PEMANFAATAN ECENG GONDOK UNTUK PRODUKSI BIOETANOL BERBASIS LIMBAH LIGNOSELULOSA (STUDI PRODUKSI ENZIM SELULASE DAN HIDROLISIS ENZIMATIS) Elwin (136100117011001) Pembimbing : Dr. Ir. Joni Kusnadi, M. Si Yusuf Hendrawan, S. TP, M. App Life Sc, Ph. D

Pentingnya Energi Buat Kehidupan Industri Mekanisasi Transportasi 2011 2012 2013 2014 2015 2016 28 30 35 38 45 50 Energy Production In Indonesia in Million TOE (ESDM, 2012) 2001 2004 2007 2009 2010 2011 800 900 930 950 1000 1100 Energy Consumption In Indonesia in Million SBM (ESDM, 2012)

Bioetanol 91.5% 0.4% 7.9% 0.3% Source : EPA, 2010

A.Niger & T.Viride Eceng Gondok Enzim Selulase Enzim Komersial Bioetanol

Tujuan Penelitian Objectives Untuk mengetahui aktivitas enzim selulase yang dihasilkan dari proses optimasi produksi enzim oleh Aspergilus niger . Objectives Untuk mengetahui aktivitas enzim selulase yang dihasilkan dari proses optimasi produksi enzim oleh Trichoderma viride. Untuk mengetahui hasil optimai produksi enzum selulase dari A.niger dengan metode respon permukaan.

Tujuan Penelitian Untuk mengetahui hasil optimai produksi enzum selulase dari T.viride dengan metode respon permukaan. Untuk mengetahui hasil optimasi hidrolisis enzim selulase kasar A.niger dan T.viride terhadap substrat eceng gondok. Untuk mengetahui pengaruh pretreatment NaOH dan H2SO4 terhadap hasil hidrolisis serbuk eceng gondok.

Berkembang biak secara vegetatif dan generatif, (Pasaribu, 2007) Eceng Gondok Berkembang biak secara vegetatif dan generatif, (Pasaribu, 2007) Eceng Gondok Berkembang biak dengan sangat cepat, mencapi 2x dalam 7 hari (Pasaribu, 2007) Pembuangan Eceng Gondok dari perairan US$ 20-50 Juta/Tahun (UNEP, 2013)

Eceng Gondok Lignin 10 % Selulosa 25 % Hemiselulosa 35 % ASH 20 % Nitrogen 3% (Awatshi, 2012)

Proses Produksi Bioetanol Fermentation Destilation Hydrolysis Fermentation Destilation Pretreatment Hydrolysis Fermentation Destilation (Fajar, 2013)

Pretreatment Enzyme Enzyme Chemical +Heat (Awatshi, 2012) Cellulose Hemicellulose Lignin (Awatshi, 2012)

Sing et al, 2013( 2% H2O2, NaOH, H2SO4, Autoclaf 121°C, 15 Psi, 40 Menit, Lignin turun 4.8%-2.1%) Awatshi et al, 2013 (2% HCl, NaOH, H2SO4, Autoclaf 121°C, 15 Psi, 15 Menit, Gula Reduksi 11.775 mg/g Pretreatment Ahmed et al, 2011(NaCl+ H2O2, Nacl+NaOH, H2O2, Lignin turun dari 17%-1.98% ) Pretreatment NaOH, H2SO4 (2%,3%,4%,5%), Autoclaf, Autoclaf 121°C, 15 Psi, 40 Menit

Hidrolisis Endoglucanase Exoglucanase B-glucosidase (Lynd et al, 2003)

Ijaz et al, 2011(Alternaria alternata, T. Jagung, 3 hari, 34°C, pH 5 Ijaz et al, 2011(Alternaria alternata, T. Jagung, 3 hari, 34°C, pH 5.5, 22.41 U/gr) Gautam et al, 2010 ( T. viride, Limbah Sayuran, 6 hari pH 6.5, 45°C, Endo 1.88 U/ml, Ekso 1.8 U/ml, B-glukosidase 1.56 U/ml Produksi Selulase Mrudula et al, 2011(A. niger, Sabut Kelapa 3 hari, 30°C, pH 6, Kadar air 1:2, CMCase 4.44 U/gr, FPase 2.51 U/gr) Produksi enzim selulase oleh A.niger dan T.viride dengan substrat eceng gondok masih belum dilakukan

Inshi et al, 2014(Enzim komersial, substrat 2% (b/v), 54 jam, pH 4 Inshi et al, 2014(Enzim komersial, substrat 2% (b/v), 54 jam, pH 4.8, 92 mg/ml) Das et al, 2015 ( Enzim komersial, Substrat 7%, Selulase 60 U/gr, Xilanase 300 U/gr, surfaktan 0.15%, 0.5357 g/g Hidrolisis Raven et al, 2011(Enzim komersial, substrat 11.25%, 60 jam, enzim 50 FPU/gr, Surfaktan 0.2%, 0.685 g/g) Hidrolisis enzimatis dengan enzim selulase yang diproduksi oleh A.niger dan T.viride

Fermentasi Saccharomyces cerevisiae Ethanol Ethanol Glucose Glucose (Ratna, 2012)

Alat dan Bahan Eceng Gondok Enzim Selulase NaOH,H2SO4 Bufer Sitrat A. Niger dan T. viride DNS Aquades Inkubator Spectrophotometer Disk Mill Autoclaf Oven pH Meter Ayakan 60 Mesh Micropipette

Waktu dan Tempat Produksi Enzim Optimasi RSM Optimasi Hidrolisis Persiapan Sampel Mei 2015 Produksi Enzim Juni-Agustus 2015 Optimasi RSM Sept-Okt 2015 Optimasi Hidrolisis Nov-Des 2015

Sample Preparation Diambil dari Bendungan Selorejo Dipotong ± 2 cm Dioven 100 °C, 24 H Digiling (disk mill) Ayakan 60 mesh Serbuk Eceng Gondok Singh et al, 2013; Ahmed et al, 2011; Inshi et al, 2014)

Dimasukan ke tabung reaki Produksi Enzim Selulase 5. 85 gr PDA 150 ml Aquades Dimasukan ke tabung reaki 5 ml Autoclaf 121 °C, 15 Psi, 15 Menit Dimiringkan Sampai siap digunakan A.niger dan T.viride

Dicampur dengan 5 ml aquades steril Produksi Enzim 3 gr serbuk eceng gondok Autoclaf 121 °C, 15 Psi, 15 Menit A.niger dan T.viride Dicampur dengan 5 ml aquades steril Diinokulasikan ke eceng gondok steril Diinkubasi Waktu (2-10 hari) Suhu (30,34,38°C)

Pemanenan dan Pengujian Aktivitas Enzim Selulase Substrat hasil fermentasi Ditimbang 1 gram Ditambah Aquades steril 4 ml Dimasukan ke dalam ependorf Adsorbansi 540 nm Direaksikan dengan substrat Sentrifuse 8000 rpm, 10 menit, 4°C Sentrifuse 8000 rpm, 10 menit, 4°C

RSM Aspergilus niger

RSM Trichoderma viride

Pretretament 10 gr serbuk eceng gondok Dicampur dengan NaOH, H2SO4, H2O2 (2,3,4,5% v/w) Diautoclaf 121 °C, 15 Psi, 40 minutes Disaring dengan kertas saring Hidrolisis dengan crude enzyme A. niger : T.viride Analisis Glukosa Singh et al, 2013; Ahmed et al, 2011; Inshi et al, 2014; Ravend et al, 2011)

Hidrolisis (Inshi et al, 2014) Suhu 30, 38, 46, 54°C Eceng gondok Pretreatment dan non-pretretament Dihidrolisis dengan Enzim Selulase kasar A.niger : T.viride (1:0, 0:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:1, 4:1) Inkubasi (4-24 jam) Suhu 30, 38, 46, 54°C Analisa Glukosa (Inshi et al, 2014)

Glucose Analysis (Rangarajan et al, 2013) 0.1 gr Glukosa dicampur dengan 100 ml aquades (100, 200, 300, 400, 500, 1000 ppm) 125 µl sampel glukosa dicampur dengan 125 µl DNS Dipanaskan pada waterbath 100°C, 10 menit OD diukur pada 540 nm Standard Curve (Rangarajan et al, 2013)

Optimasi Waktu Inkubasi Aspergilus niger 2.40 U/g (P>0.05) 2.40 U/g (P<0.05) 2.40 U/g (P>0.05) Abubakar at al, 2013 (96, 120 jam) Ali at al, 2013 (kulit jeruk, 70 jam) Lee at al, 2003 (akibat akumulasi dari selobiosa, dimer glukosa, FBI

Optimasi Suhu Inkubasi 4.38 U/g (P<0.05) 3.22 U/g (P<0.05) 2.14 U/g (P>0.05) Mrudula et al, 2011 (sabut kelapa, CMCase, FPase, 30°C) Saliu et al, 2012 (Tongkol jagung CMCase, 50°C) Lonsane et al, 1985 (Suhu optimum A. niger 30°C- 35°C)

Optimasi Penambahan Air 4.38 U/g (P<0.05) 1.99 U/g (P>0.05) 2.26U/g (P>0.05) Mrudula et al, 2011 (Produksi enzim selulase A.niger, KA 1:2 v/b) Terlalu rendah tidak larut, tegangan air tinggi, terlalu tinggi rendahnya porositas

Optimasi Sumber Karbon 1.94 U/g (P>0.05) 5.62 U/g (P>0.05) 3.17 U/g (P>0.05) 1.99 U/g Vastrad et al, 2011 (rymfamycin Amycolatopsis mediterranei MTCC 14 , Glukosa) Mukhtar et al, 2012 (Antibiotik, Streptomyces capoamus, maltosa)

Optimasi Jumlah Karbon 5.81 U/g (P<0.05) 5.69 U/g (P>0.05) 5.83 U/g (P<0.05) Mukhtar at al, 2012 (Streptomyces capoamus, Maltosa, 2%,2.5%) Mukhtar at al, 2012 (kecil kebutuhan tidak tercukupi, besar memicu FBI)

Pengaruh Penambahan Sumber Nitrogen 7.91 U/g 6.90 U/g 5.83 U/g 6.19 U/g 5.69 U/g 5.81 U/g

Optimasi Waktu Inkubasi Trichoderma viride 2.11 U/g (P>0.05) 3.38 U/g (P>0.05) 1.81 U/g (P<0.05) Guatam at al, 2010 (Enzim selulase Trichoderma viride, 6 hari, strees, nutrisi) Winarsih at al, 2010 (Enzim selulase Trichoderma reseei, 6 hari, strees, nutrisi)

Optimasi Suhu Inkubasi 2.74 U/g (P<0.05) 2.11 U/g (P<0.05) 1.81 U/g (P<0.05) Mukhopaday at al, 1998 (Enzim selulase Trichoderma viride, 30°C) Murao at al, 2010 (Enzim selulase Trichoderma viride, 40°C) Lu at al, 2003 (Suhu optimum produksi enzim selulase berbeda untuk tiap mikroba dan substrat)

Optimasi Penambahan Air 1.81 U/g (P<0.05) 2.74 U/g (P<0.05) 2.11 U/g (P<0.05) Smitha et al, 2014 (Fermentasi secara SSF menggunakan Jamur lebih menyukai kadar air terbatas)

Optimasi Sumber Karbon 2.18 U/g (P>0.05) 3.46 U/g (P>0.05) 3.05 U/g (P>0.05) Pangestu et al (Aktivitas enzim rendah karena glukosa yang terlalu banyak atau terlalu mudah diserap oleh mikroba)

Optimasi Jumlah Karbon 5.81 U/g 5.83 U/g 5.69 U/g Mukhtar at al, 2012 (Streptomyces capoamus, Maltosa, 2%,2.5%)

Optimasi Penambahan Sumber Nitrogen 7.07 U/g 4.78 U/g 4.63 U/g 4.41 U/g 3.51 U/g 3.05 U/g

RSM Aspergilus niger

Waktu Inkubasi 8.68 P=0.0031 LOF=0.4806 P=0.0002 P=0.0017 LOF-0.3497 LOF=0.1854 𝐴𝑣𝑖𝑐𝑒𝑙𝑙= 6.26+0.097𝐴−0.62𝐵+0.28𝐶+0.042𝐴𝐵−0.13𝐴𝐶+0.34𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.67 𝐵 2 −1.30 𝐶 2 = 6.26+0.097𝐴−0.62𝐵+0.28𝐶+0.042𝐴𝐵−0.13𝐴𝐶+0.34𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.67 𝐵 2 𝐴𝑣𝑖𝑐𝑒𝑙𝑙= 6.26+0.097𝐴−0.62𝐵+0.28𝐶+0.042𝐴𝐵−0.13𝐴𝐶+0.34𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.67 𝐵 2 −1.30 𝐶 2 CMC= 7.18+0.60𝐴−0.30𝐵−0.53𝐶−0.84𝐴𝐵−0.64𝐴𝐶+1.08𝐵𝐶−1.38 𝐴 2 −1.82 𝐵 2 −0.91 𝐶 2 = 7.18+0.60𝐴−0.30𝐵−0.53𝐶−0.84𝐴𝐵−0.64𝐴𝐶+1.08𝐵𝐶−1.38 𝐴 2 CMC= 7.18+0.60𝐴−0.30𝐵−0.53𝐶−0.84𝐴𝐵−0.64𝐴𝐶+1.08𝐵𝐶−1.38 𝐴 2 −1.82 𝐵 2 −0.91 𝐶 2 𝑆𝑒𝑙𝑜𝑏𝑖𝑜𝑠𝑎= 6.56+0.11𝐴−0.69𝐵+0.31𝐶+0.046𝐴𝐵−0.15𝐴𝐶+0.38𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.64 𝐵 2 −1.33 𝐶 2 = 6.56+0.11𝐴−0.69𝐵+0.31𝐶+0.046𝐴𝐵−0.15𝐴𝐶+0.38𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 𝑆𝑒𝑙𝑜𝑏𝑖𝑜𝑠𝑎= 6.56+0.11𝐴−0.69𝐵+0.31𝐶+0.046𝐴𝐵−0.15𝐴𝐶+0.38𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.64 𝐵 2 −1.33 𝐶 2

P=0.0031 Suhu 34.50 LOF=0.4806 P=0.0002 LOF-0.3497 P=0.0017 LOF=0.1854 𝐴𝑣𝑖𝑐𝑒𝑙𝑙= 6.26+0.097𝐴−0.62𝐵+0.28𝐶+0.042𝐴𝐵−0.13𝐴𝐶+0.34𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.67 𝐵 2 −1.30 𝐶 2 = 6.26+0.097𝐴−0.62𝐵+0.28𝐶+0.042𝐴𝐵−0.13𝐴𝐶+0.34𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.67 𝐵 2 𝐴𝑣𝑖𝑐𝑒𝑙𝑙= 6.26+0.097𝐴−0.62𝐵+0.28𝐶+0.042𝐴𝐵−0.13𝐴𝐶+0.34𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.67 𝐵 2 −1.30 𝐶 2 CMC= 7.18+0.60𝐴−0.30𝐵−0.53𝐶−0.84𝐴𝐵−0.64𝐴𝐶+1.08𝐵𝐶−1.38 𝐴 2 −1.82 𝐵 2 −0.91 𝐶 2 = 7.18+0.60𝐴−0.30𝐵−0.53𝐶−0.84𝐴𝐵−0.64𝐴𝐶+1.08𝐵𝐶−1.38 𝐴 2 CMC= 7.18+0.60𝐴−0.30𝐵−0.53𝐶−0.84𝐴𝐵−0.64𝐴𝐶+1.08𝐵𝐶−1.38 𝐴 2 −1.82 𝐵 2 −0.91 𝐶 2 𝑆𝑒𝑙𝑜𝑏𝑖𝑜𝑠𝑎= 6.56+0.11𝐴−0.69𝐵+0.31𝐶+0.046𝐴𝐵−0.15𝐴𝐶+0.38𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.64 𝐵 2 −1.33 𝐶 2 = 6.56+0.11𝐴−0.69𝐵+0.31𝐶+0.046𝐴𝐵−0.15𝐴𝐶+0.38𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 𝑆𝑒𝑙𝑜𝑏𝑖𝑜𝑠𝑎= 6.56+0.11𝐴−0.69𝐵+0.31𝐶+0.046𝐴𝐵−0.15𝐴𝐶+0.38𝐵𝐶−0.96 𝐴 2 −0.64 𝐵 2 −1.33 𝐶 2

Prediksi RSM Untuk Produksi Enzim Selulase Oleh A. niger

RSM Trichoderma viride

P=0.0075 P=0.0020 LOF=0.7875 LOF=0.0638 P=0.0020 LOF=0.0638 𝑆𝑒𝑙𝑜𝑏𝑖𝑜𝑠𝑎= 6.00+0.15 𝐴−0.14𝐵−0.044𝐴𝐵−1.36 𝐴 2 −1.73 𝐵 2 𝐴𝑣𝑖𝑐𝑒𝑙𝑙= 5.68+0.15 𝐴−0.14𝐵−0.050𝐴𝐵−1.38 𝐴 2 −1.68 𝐵 2 = 5.68+0.15 𝐴−0.14𝐵−0.050𝐴𝐵 𝐴𝑣𝑖𝑐𝑒𝑙𝑙= 5.68+0.15 𝐴−0.14𝐵−0.050𝐴𝐵−1.38 𝐴 2 −1.68 𝐵 2 𝐶𝑀𝐶= 7.77+0.069𝐴−0.27𝐵+0.028𝐴𝐵−2.39 𝐴 2 −1.56 𝐵 2 = 7.77+0.069𝐴−0.27𝐵+0.028𝐴𝐵 𝐶𝑀𝐶= 7.77+0.069𝐴−0.27𝐵+0.028𝐴𝐵−2.39 𝐴 2 −1.56 𝐵 2

Prediksi RSM Untuk Produksi Enzim Selulase Oleh T.viride

Optimasi Campuran Enzim Kasar 5781 5938 5334 4774 4558 4798 4531 4051 3924 366.8 Juhasz et al, 2003 dan Winarsih, 2013 A. Niger lebih banyak menghasilkan β-glukosidase T.viride lebih banyak menghasilkan endoglukanase, eksoglukanase

Optimasi Suhu Inkubasi 5938 5104 3401 3378 Data awal A.niger (34°C) T.viride (30°C) Wewen et al, 2012 (enzim komersial 50°C, 80%, 60°C 45%) Inshi et al, 2014 (enzim komersial 50°C, 95%, 60°C 30%)

Optimasi Waktu Inkubasi 6481 5938 5901 4871 4551 4391 Wewen et al, 2012 (25 jam 6 mg/ml, 30 jam 5 mg/ml) Inshi et al, 2014 (25 jam 50, 95%, jam 80 90%)

Optimasi Kosentrasi Substrat 8604 8161 6481 6654 6731 Inshi et al, 2012 ( enzim selulase komersial 2%, 95%, 2.4% 60%) Xia et al, 2012 ( Gula reduksi turun saat kosentrasi substrat ditingkatkan, 20g/l, 94.6%) Kosentrasi tinggi, viskositas tinggi, transfer massa menurun

Pretreatement 2334 2018 1861 1914 934 1274 1101 1028, 1031 1168 844 734 Ghabane et al, 2015 (Pretreatment alkali meningkatkan gula reduksi 0.25%-1%)

Pretreatment 2351 1311 1281 964 1324, 1174, 1268 1354, 1208, 1234 774 521 Mae et al, 2010 (Kadar Asal Sulfat Optimum untuk Pretreatment eceng gondok 0.25% (366mg/g) Xia et al, 2013 (Kadar Asal Sulfat Optimum untuk Pretreatment eceng gondok 1% (48.3g/100g)

Kesimpulan dan Saran Aktivitas enzim selulase tertinggi pada proses produksi enzim oleh Aspergilus niger didapatkan pada waktu inkubasi 8 hari, suhu inkubasi 34°C, Penambahan air 0% (v/b), sumber karbon glukosa dan jumlah karbon 8% dan sumber nitrogen NaNO3 adalah sebesar 7.91 terhadap substrat CMC, 6.19 terhadap substrat Avicell dan 6.90 terhadap substrat Selobiosa. Aktivitas enzim selulase tertinggi pada proses produksi enzim oleh Trichoderma viride didapatkan pada waktu inkubasi 6 hari, suhu inkubasi 30°C, kadar air 0% (v/b), sumber karbon glukosa dan jumlah karbon 8% dan sumber nitrogen NaNO3 4% adalah sebesar 7.07 terhadap substrat CMC, 4.63 terhadap substrat Avicell dan 4.78 terhadap substrat Selobiosa. Optimasi metode respon permukaan produksi enzim selulase dari Aspergilis niger signifikan untuk persamaan kuadratik dengan prediksi kondisi optimum yaitu waktu inkubasi 8.68 hari, Suhu 34.5°C dan Kadar Glukosa 8.04% menghasilkan aktivitas enzim selulase 7.10 U/gram terhadap CMC, 6.10 U/gram terhadap Avicell dan 6.39 gram terhadap Selobiosa.

Optimasi metode respon permukaan produksi enzim selulase dari Trichoderma viride signifikan untuk persamaan kuadratik dengan prediksi kondisi optimum yaitu waktu inkubasi 5.94 hari, Kadar Glukosa 7.80% menghasilkan aktivitas enzim selulase 7.10 U/gram terhadap CMC, 5.67 U/gram terhadap Avicell dan 5.99 U/gram terhadap Selobiosa.. Hidrolisis enzim selulase kasar Aspergilus niger dan Trichoderma viride terhadap substrat eceng gondok optimum pada campuran 3:1 (v/v), suhu inkubasi 30°C, waktu inkubasi 8 jam dan kosentrasi substrat 25% (b/v) dengan glukosa yang dihasilkan sebesar 8605,7 mg/l. Hidrolisis substrat eceng gondok yang di-pretretament dengan H2SO4 menghasilkan glukosa sebesar 2351 mg/l lebih tinggi dibandingkan dengan pretretament NaOH yaitu sebesar 2334 mg/l.

Kesimpulan dan Saran Enzim selulase dari Aspergilus niger dan Trichoderma viride yang digunakan pada penelitian ini masih berupa enzim kasar (crude enzyme). Penggunaan enzim kasar diduga masih belum efektif pada proses hidrloisis substrat eceng gondok sehingga penelitian lanjutan pemurnian enzim dari Aspergilus niger dan Trichoderma yang merupakan kelanjutan dari penelitian ini sangat perlu dilakukan mengingat harga enzim murni yang mahal secara komersial.

[Glukosa (mg/L) Absorbansi Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Rerata 100 0.070 0.069 0.095 0.078 200 0.140 0.134 0.149 0.141 300 0.239 0.245 0.260 0.248 400 0.348 0.351 0.378 0.359 500 0.432 0.431 0.433 1000 1.002 0.982 0.964 0.984

3 Method Sample Preparation Sample Pretreatment Cellulose Hydrolisis Glucose Fermentation 80 mesh screen Cut +2 cm Milled (Disk Mill) Unpretreated WH Collected from Selorejo valley Dried 100°C,24 H Mixed with NaOH, H2SO4, H2O2 (8% v/v) Filter Clothes 5 gr of Unpretreated WH Auctoclve 121 °C, 15 Psi, 40 minutes Glucose Anlysis Hydrolisis Hydrolyzed with Commercial Cellulase 15 FPU/g Pretretaed WH Low : 1.6% High : 2.4% Glucose Anlysis Incubation time Low : 42 h High : 66 h T= 37, 40, 43, 46 °C, pH 5.0, 4 H 10 mL of Hydrolysate 1,2,3,4,5,6 H pH 5.0 Ethanol Analysis Kit Assay IC (2%, 4%, 6%, 8%, 10%), T= 37 °C, pH 5, 4 H pH Low : 2.8 High : 6.8

Optimasi Waktu Inkubasi Optimasi Suhu 30, 50, 60 °C Optimasi Waktu Inkubasi 0-72 jam Biomass concentration (%) Enzyme Loading Incubation time Optimasi pH 2.8, 3.8, 4.8, 5,8 dan 7,8 Result 2%, 54 jam, 50 °C, pH 4.8 92 mg/ml (Inshi et al, 2014) Surfactan Result (Ravendraan et al, 2011)

Substrate Concentration : +1 (2.4%), -1 (1.6%) Incubation time : ENERGY TV Start 10 mL of Hydrolisate 15 FPU/g substrate Substrate Concentration : +1 (2.4%), -1 (1.6%) Incubation time : +1 (66 h) -1 (42 h) pH: +1 (6.8), -1 (2.8) Optimation of Substrat Concentration, Incubation time, pH Glucose Analysis Finish

1 pH 5.0 37 °C pH 5.0 4 Jam 1 pH 5.0 4 Jam 2 10 mL of Hydrolisate 10 mL of Hydrolisate 10 mL of Hydrolisate 37, 40, 43, 46°C 2%, 4%, 6%, 8%, 10% 1,2,3,4,5,6 Hour

G L Y C O S I P A T H W

G L Y C O S I P A T H W

Fermentation 10 mL of Hydrolysate IC (2%, 4%, 6%, 8%, 10%) T : 37 °C pH : 5.0 4 Hour Ethanol Was Analyzed T(37,40,43,46 °C) IC : Opt pH : 5.0 4 Hour IT (1,2,3,4,5,6 Hour) IC : Opt T : Opt pH : 5.0 Ethanol Was Analyzed