Teknik analisis DNA Oleh : dr.Syazili Mustofa Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler FK Universitas Lampung

Bahasan Isolasi DNA Analisis DNA PCR Sekuensing Hibridisasi

Isolasi DNA definisi: proses pemurnian DNA dari berbagai sumber. Tujuan: memisahkan DNA dari komponen sel lain

Aplikasi isolasi DNA : 1- scientific: mengintroduksikan DNA ke sel  gene clonning 2- kedokteran : memprediksi virulensi mikroorganisme 3- forensik : penggunaan DNA untuk identifikasi individu dan paternity determination.

Cara untuk mengisolasi DNA. A. Menghancurkan materi lain yang ada disekitar DNA B. Menyingkirkan protein dan kontaminan lainnya C. Recovery of the DNA

Sampel Sumber : Sampel dapat diisolasi dari organisme hidup atau mati Darah Buffy coat Material tulang Sel Buccal Kultur sel Cairan amnion Sputum, urin, dll.

DNA Purification & Quantification Memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya (protein, lipid, RNA, dll.) Menghindari fragmentasi molekul DNA oleh endogenous nucleases (DNase enzymes)  membuat DNases tidak aktif menggunakan pemanasan atau chelating agents.

Ekstraksi DNA Langkah langkah: Melisis sel Protein Menyingkirkan kontaminan Protein RNA makromolekul lain Menentukan konsentrasi DNA yang sudah dimurnikan

1. Lysis of the Cell Menggunakan ditergen untuk melarutkan lipid membran.

2. Memisahkan DNA DNA harus dipisahkan dari protein dan debris seluler. Metode pemisahan a) Organic extraction b) Salting out

a) Pemisahan dengan ekstraksi organik phenol: chloroform digunakan untuk ekstraksi DNA.

b) Pemisahan dengan Salting Out Pada konsentrasi garam yang tinggi, protein mengalami dehidrasi  kehilangan kelarutan mengendap Biasanya digunakan : sodium chloride, potassium acetate or ammonium acetate. Protein yang terpresipitasi disingkirkan dengan sentrifugasi DNA terdapat dalam supernatan.

Pemisahan dengan Salting Out Salting out method: Cell lysis. Protein digestion by proteinase enzyme. Protein precipitation by high salt concentration. Centrifugation will remove the precipitated proteins. The supernatant contains the DNA. DNA is then precipitated by adding ethanol. The precipitated DNA is resuspended in the desired buffer.

Ethanol precipitation: -Precipitation of DNA: Absolute Ethanol is layered on the top of concentrated solution of DNA - Fibers of DNA can be withdrawn with a glass rod - Washing of DNA - Desalt DNA: Most salts are soluble in 70% ethanol

Menggunakan kit komersial purifikasi DNA The common lysis solutions contain A. sodium chloride B. Trimethamine (also known as tris ) , which is a buffer to retain constant pH C. Ethylendiaminetetraacetic (EDTA) , which binds metal ions D. Sodium dodecyl sulfate (SDS) which is a detergent . E. An enzyme used in DNA extraction is protienase K

3- Heat denaturation Achieved by boiling samples 3- Heat denaturation Achieved by boiling samples. Heating of a sample to 100 c releases DNA into the solution but also denatures it by separating the two strand. Drawbacks: There are remaining inhibitors in the form of degraded proteins and other organic compound or ions .

4- Magnetic beads with DNA binding capacity Magnetic beads are coated with DNA antibodies or silica to bind to DNA. Samples are lyses & and then treated with proteinase K. The lysates are then applied to the beads. Resin is subsequently washed & DNA is eluted of it at 65c Magnetic beads are separated from the sample on a magnetic stand.

Kesimpulan isolasi DNA: There are three basic & two optional steps in a DNA extraction : 1- lisis sel, untuk mendapatkan DNA. 2- menyingkirkan membran sel  menambahkan ditergen atau surfaktan. 3- menyingkirkan protein dengan menambahkan protease . 4- menyingkirkan RNA by menambahkan Rnase. 5- mempresipitasikan DNA dengan alkohol biasanya ice cold ethanol.  untai DNA akan beraggregasi  pellet pada sentrifugasi .

Evaluasi DNA Extraction & Purification: Konsentrasi DNA  mengukur intensitas absorbansi dengan spektrofotometer & membandingkannya dengan kurva standar konsentrasi DNA yang sudah diketahui. Mengukur intensitas absorbansi DNA pada 260nm & 280nm  kemurnian DNA Kemurnian DNA : A260/A280 ratio: 1.7 – 1.9 konsentrasi DNA (μg/ml): A260 X 50 DNA yang dihasilkan : konsentrasi DNA X volume total larutan DNA.

Polymerase Chain Reaction (PCR) Dengan jumlah DNA yang sedikit  diamplifikasikan  jumlah DNA yang cukup untuk dideteksi dengan elektroforesis

Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Denaturation Annealing Extension 5’ 3’ 5’ 3’

Number of DNA molecules Rate of PCR 2n Initial DNA 1 2 4 8 Number of DNA molecules

Copies of DNA=2N

DNA sequencing Sequencing digunakan untuk menentukan urutan nukleotida yang tepat pada suatu molekul DNA. metode di-deoxy Sanger di-deoxy melibatkan sintesis DNA oleh DNA polymerase. Sintesis DNA diterminasi pada nukleotida spesifik yang di inkorporasi oleh di-deoxy nucleotida ( nukleotida yang kehilangan OH pada C nomor 3)

Analisi Sequence Empat reaksi yang berbeda menghasilkan fragmen DNA yang diterminasi secara random di masing-masing empat nukleotida. Sampel ini selanjutnya di electrophoresis. Fragmen terpendek (yang diterminasi paling dekat dari primer ) bergerak lebih cepat dari pada fragme yang lebih panjang.

Reaksi DNA sequencing dapat dilabel dengan radioaktif. A C G T Reaksi DNA sequencing dapat dilabel dengan radioaktif. Pita diditeksi dengan X-ray film exposure. Sekuen dapat dibaca dari arah 5’ ke 3’ dari bawah gambar menuju ke atas A A T C T A A C G

Kekurangannya Memakan tempat dan waktu Solusi: melabel ddNTP dengan flourosen  masing masing ddNTP mempunyai warna berbeda.

07_03.jpg 07_03.jpg 38

Mesin DNA sequencers otomatis menggunakan terminator dideoxy yang dilabel dengan empat fluorescent berbeda. Keempat reaksi dapat dilakukan secara bersamaan dalam reaksi tunggal.

Fragmen yang ditandai flourosen diolah oleh elektroforesis kapiler dan dideteksi oleh sebuah flourometer DNA sequence dibaca secara otomatis.

Beckman CEQ 2000, 8 capillary ABI Prism 3730, 96 capillary

Fluorescene In Situ Hybridization Hibridisasi pelacak dengan DNA/RNA di dalam sel. Sumber DNA: sayatan jaringan, kultur mamalia, kultur serangga, darah (sel darah putih). Pemanasan sampel DNA Hibridisasi dengan pelacak bertanda (fluoresens)

Analisis FISH gen RUNX1 yang mengalami peningkatan jumlah kopi pada penderita leukemia akut karena polisomi pada kromosom 21. RUNX1: Merah; TEL: Hijau

06_16.jpg 06_16.jpg