“DNA REKOMBINAN”

Apa sih DNA Rekombinan itu ??? teknologi DNA rekombinan berkembang pada tahun 1970-an teknologi DNA rekombinan memungkinkan bagi kita untuk mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan bahkan dapat diekspresikan.

DASAR TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme seksual. Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu:

Konjugasi b. Transformasi c. Transduksi.

PERANGKAT TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN enzim restriksi DNA ligase plasmid Bakteri pustaka genom

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER Vektor: pembawa molekul DNA dlm proses pengklonan gen. Vektor yang biasa digunakan: Plasmid, Fage, kromosom buatan dr khamir (YAC= yeast artificial chromosome), dan Cosmid. Plasmid biasa digunakan untuk membawa molekul DNA berukuran kecil, sedangkan untuk molekul DNA yang besar digunakan fage, cosmid atau YAC.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 1. PLASMID Merupakan DNA utas ganda sirkuler berukuran kecil yg terdapat di dlm sitoplasma dan dpt melakukan replikasi secara otonom. Ciri penting plasmid: 1. Dapat melakukan replikasi, 2. Tdp diluar kromosom , 3. Secara genetik dpt ditransfer secara stabil. Tdp secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yg disesuaikan dg keperluan didlm manipulasi genetik. Satu sel dpt mengandung lebih dr satu kopi. Plasmid tdp dlm sitoplasma prokryot maupun eukaryot seder hana uniselluler. Selain pada bakteri, plasmid juga tdp pd Saccharomyces cereviceae.

Plasmid dikelompokkan berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yg dikandungnya: Plasmid F (fertilitas) membawa gen tra, yg bertanggung jawab thd proses konjugasi Plasmid R (resistensi) mengndung gen resistensi thd antibiotik atau logam berat Plasmid yg mengandung gen penyandi toksin dan bakteriosin, seperti ColE1 dari E.coli. Plasmid degradatif yg mempunyai kemampuan utk melakukan metabolisme molekul organik spt toluen (TOL dr Pseudomonas putida).

Untuk kloning gen, plasmid yg ideal bersifat: Plasmid virulensi: yg bertanggung jawab thd patogenositas dr sel inang (pTi pd Agrobacterium tumefaciens). Untuk replikasi, plasmid dpt dlm keadaan: terpisah dari kromosom (non-integratif), dan ada yg terintegrasi ke dlm kromosom bakteri (episom). Untuk kloning gen, plasmid yg ideal bersifat: a). berukuran kecil, b). minimal memiliki satu situs penyisipan yg mudah diidentifikasi, dan c). membawa sifat yg mudah utk seleksi bagi inang yg mengandungnya. Efisiensi transformasi berbanding terbalik dengan ukuran plasmid, semakin kecil ukuran plasmid efisiensi transformasi semakin besar.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 2. FAGE Fage atau bakteriofage adalah virus yg menginfeksi bakteri. Struktur fage sangat sederhana, tersusun dr molekul DNA yg membawa beberapa gen dan molekul protein yg membungkusnya yg disebut dg Kapsid. Tdp 2 macam siklus hidup fage: 1). Siklus litik, dan 2). Siklus lisogeni. Siklus litik diakhiri dg pelepasan fage baru dr bakteri inang karena tjd lisis, sedangkan pd lisogeni, DNA fage tersisip di dlm kromosom bakteri yg berfungsi sgb sel inangnya.

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 3. COSMID Vektor yg diturunkan dr plasmid yg mengandung ujung kohesif (cos) dari fage . Merupakan molekul DNA hibrid antara fage  dan plasmid bakteri. Di dlm bakteri, cosmid membentuk molekul sirkuler spt halnya plasmid, dan tdk dapat melisis sel ingnya krn tidak (atau sedikit sekali) mengandung gen .

VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 4 VEKTOR UNTUK KLONING MOLEKULER 4. KROMOSOM BUATAN KHAMIR (YEATS ARTIFICIAL CHROMOSOME, YAC). Diperlukan dalam pengklonan DNA yg ukurannya besar. Pada beberapa gen eukaryot, tdp gen yg ukurannya sangat besar seperti Cyztic fibrosis pada manusia yg besarnya 240kb, sehingga baik plasmid, fage maupun cosmid tidak bisa digunakan sebagai vektor.

TEKNIK DNA REKOMBINAN Ada 4 teknik yaitu : Teknik Isolasi DNA Teknik Pemotongan DNA Teknik Penggabungan DNA. Teknik Pemasukkan DNA ke dalam sel hidup.

TEKNIK ISOLASI DNA Teknik isolasi DNA dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA.

TEKNIK PEMOTONGAN DNA enzim yang dapat memotong DNA utas ganda dikenal dengan enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi ini hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom yaitu urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini: 5'-GATATC-3‘ :::::: 3'-CTATAG-5'

HASIL PEMOTONGAN DNA Secara umum berdasarkan hasil pemotongan DNA double strain dengan enzim endonuklease memiliki dua bentuk yaitu: 1. hasil pemotongan sticky end (ujung runcing) 2.hasil pemotongan blunt end (ujung tumpul) Gb. Ligation of Sticky Ends DNA Gb. Ligation of Blunt Ends DNA

TEKNIK PENGGABUNGAN DNA Setelah pemotongan DNA, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor menggunakan enzim DNA ligase. DNA ligase

TEKNIK PEMASUKAN DNA KE SEL HIDUP Setelah melakukan ligasi atau penggabungan DNA maka proses selanjutnya adalah memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot sehingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan.

Gb. Teknik DNA Rekombinan

BLUE WHITE SELECTION Transformasi dapat dikatakan berhasil apabila rangkaian DNA yang diintroduksikan dapat disisipkan ke genom sel inang (bakteri), diekspresikan, dan terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya.

Seleksi bakteri pembawa DNA rekombinan seleksi resistensi antibiotika seleksi warna membedakan antara bakteri yang sudah dimasuki DNA plasmid dan mana yang tidak Membedakan antara bakteri yang plasmidnya memiliki insert ataukah tidak

Seleksi Resistensi Antibiotika Pada umumnya bakteri tidak dapat hidup dan tumbuh pada media yang mengandung antibiotik. Maka dari itu pada DNA plasmid yang ditransformasikan harus ada gen penyandi antibiotik resisten agar bakteri hostnya menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik. Jadi bakteri yang tidak berhasil disusupi oleh plasmid akan mati dengan sendirinya.

Seleksi Warna Karena reaksi ligasi tidak akan 100% berhasil menyambungkan vektor dan insert. untuk mengetahui keberhasilan proses ligasi atau keberadaan DNA sisipan menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Thiogalaktosida).

Seleksi Warna molekul yang mirip galaktosa menggunakan media yang mengandung X-gal dan IPTG (Isopropil Beta D Thiogalaktosida). inducer enzim β-galaktosidase koloni yang salah (fake colony) akan berwarna biru koloni hasil transformasi yang positif akan berwarna putih transformasi gen gagal transformasi gen berhasil

Transformasi Gen Berhasil (Koloni Warna Putih) karena gen Lac-Z yang semestinya berfungsi merubah senyawa X-Gal menjadi berwarna biru, tidak lagi mampu melaksanakan tugas oleh karena sudah diinterupsi oleh fragmen RAPD yang disisipkan gen lac-Z tidak akan diekspresikan dan β-galaktosidase tidak akan terbentuk Random amplified polymorphic DNA Gen Lac-Z mengkode enzim β-galaktosidase yang mengkatalisis pemecahan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa

Transformasi Gen Gagal (Koloni Warna Biru) gen lac-Z masih berekspresi dan menghasilkan enzim β-galaktosidase enzim ini akan memecah X-gal dan menghasilkan senyawa berwarna biru bisa saja terjadi karena kemungkinan fragmen yang diselipkan tidak terlalu panjang (kurang dari satu kb)

Contoh Plasmid Vektor

Gambaran Proses Blue White Selection

Tingkat keberhasilan transformasi ditentukan oleh kompetensi sel. Ukuran, konsentrasi DNA. insert  yang diklon bersifat meracuni bagi sel bakteri. fragmen yang diselipkan tidak terlalu panjang (kurang dari satu kb)

APLIKASI DNA REKOMBINAN

Insulin Insulin : produk recombinasi pertama yang diizinkan dipakai dalam pengobatan pada tahun 1982 Gen insulin yang berasal dari sapi kemudian ditentukan urutan DNA-nya setelah itu direkombinasikan di dalam suatu vektor misal plasmid kemudian dimasukan dalam sel bakteri. Selanjutnya bakteri ini mengalami transformasi dan bisa menghasilkan insulin. Ini adalah salah satu contoh aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi.

Hormon pertumbuhan manusia Contoh lain Hormon pertumbuhan manusia   TANAMAN TRANSGENIK Contoh tanaman transgenik : Tanaman yang resisten terhadap herbisida Kapas resisten dengan hama disebabkan karena penyisipan gen bakteri yang beracun terhadap serangga. Kedelai yang memproduksi kombinasi yang lebih sehat dari asam amino Bunga yang tetap segar lebih lama karena penyisipan gen

Mawar transgenik

MenggunakanTI Plasmid dari Agrobacterium tumefaciens sebagai vector MenggunakanTI Plasmid dari Agrobacterium tumefaciens sebagai vector. Ti plasmid dibawa oleh bacteri A. tumefacien. Bakteri ini mengakibatkan penyakit crown gall.

Hewan transgenik (From: AN INTRODUCTION TO GENETIC ANALYSIS 6/E BY Griffiths, Miller, Suzuki, Leontin, Gelbart ã 1996 by W. H. Freeman and Company. Used with permission.) Memproduksi protein yang berguna (factor IX untuk pengobatan hemophilia B)

DOMBA DOLLY

SEJARAH DOMBA DOLLI Kloning domba pertama sebenarnya telah dilaporkan 18 tahun yang lalu oleh Willadson (1986) yang menggunakan blastomer-blastomer embrio sebagai donor inti. Pada tahun 1997, ilmuwan dari Skotlandia mengumumkan kelahiran domba Dolly, domba yang diklone dari domba dewasa dengan transplantasi nucleus dari sel terdeferensiasi. Pada tahun 2003 (usia 6 tahun) Dolly mengalami komplikasi penyakit paru-paru yang umumnya menjangkit domba usia tua

PROSES KLONING

KLONING PADA SAPI kloning embrio sapi di seluruh dunia lebih banyak dibandingkan dengan pada spesies lainnya Maturasi oosit in vitro, fertilisasi in vitro, dan kultur embrio in vitro, telah terlaksana dengan baik pada ternak sapi, dan setiap kegiatan tersebut merupakan tahapan penting dalam proses kloning 3. Kloning pada ternak sapi telah dilakukan oleh Westhusin et al. (2001) dengan menggunakan seekor sapi Brahman jantan yang bernama Chance, yang berumur sekitar 21 tahun

Kambing Kloning telah dihasilkan menggunakan sel-sel somatik hewan dewasa dan sel-sel fetus sebagai donor inti untuk transplantasi ke ovum enuklease (Baguisi et al., 1999). Teknik kloning kambing sama dengan yang digunakan pada domba dan sapi, ovum resipien diperoleh dari oosit yang dimatangkan secara in vitro dan in vivo. tingkat kelahiran hidup sama dengan sapi dan domba, tetapi tingkat abnormalitas dan kematian baik pada fetus mapun anak yang lahir tidak sama KLONING PADA KAMBING

KLONING PADA MENCIT mencit terlihat lebih sulit dilaksanakan dibandingkan dengan sapi, domba dan kambing, dengan tingkat kelahiran hidup hanya sekitar satu persen. dari embrio yang ditransfer dapat lahir hidup (Ogura et al., 2000). Mencit kloning pertama dihasilkan lewat injeksi langsung inti sel. Metode terbaru yang lebih efisien untuk kloning mencit telah dilakukan oleh Baguisi dan overstrom (2000) dengan menggunakan metode enuclease kimiawi yang dikombinasikan dengan injeksi langsung inti donor untuk menghasilkan anak yang hidup.

produksi babi kloning sangat sulit dan tidak efisien dengan dengan daya hidup embrio yang ditransfer hanya sekitar satu persen. Percobaan pertama oleh Polejaeva et al. (2000), hasil percobaan ini menunjukkan bahwa hanya satu resipien yang mendapat transplantasi inti menjadi bunting dan melahirkan 5 ekor anak. Pada laporan kedua oleh Onishi et al. (2000), hanya satu ekor anak babi betina yang lahir dari hasil transfer 110 embrio kloning ke empat betina resipien. KLONING PADA BABI

KLONING PADA SPESIEN LAIN Spesies-spesies tersebut termasuk kucing, anjing, kuda, kelinci, tikus, dan beberapa hewan buas. kloning anjing menjadi fokus penelitian dari salah satu laboratorium di Texas. Teknik-teknik reproduksi yang repeatable dan efisien pada anjing seperti teknik superovulasi, sinkronisasi estrus, produksi embrio in vitro, belum biasa dilaksanakan. Salah satu penghambat kemajuan kloning anjing adalah terbatasnya persediaan ovum yang matang untuk digunakan sebagai resipien transfer inti

Copycat adalah hasil cloning

Variasi Efisiensi Kloning Spesies hanyalah merupakan salah satu varibel yang mempengaruhi tingkat keberhasilan kloning untuk mereproduksi genotip yang spesifik. Variable lainnya yang berpengaruh adalah tipe sel donor yang digunakan untuk nuclear tranfer. Banyak tipe sel yang telah digunakan sebagai donor untuk transfer inti.

RESIKO POTENSIAL REKAYASA GENETIK Gen sintetik dan produk gen baru yang berevolusi dapat menjadi racun. Rekayasa genetik tidak terkontrol dan tidak pasti, genom bermutasi. Penyebaran gen tahan antibiotik pada patogen oleh transfer gen horizontal, membuat tidak menghilangkan infeksi. Virus di dalam sekumpulan genom yang menyebabkan penyakit mungkin diaktifkan oleh rekayasa genetik.

“Seseorang yang berhenti belajar adalah orang lanjut usia, meskipun umurnya masih remaja. Seseorang yang tidak pernah berhenti belajar akan selamanya menjadi pemuda” -Henry Ford