Stable genetic transformation of Jatropha curcas via Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer using leaf explants Nitish Kumara,1, K.G. Vijay Ananda, D.V.N. Sudheer Pamidimarria, Tanmoy Sarkara, Muppala P. Reddya,∗,2, T. Radhakrishnanb, Tanushri Kaulc, M.K. Reddyc, Sudhir K. Soporic a Discipline of Wasteland Research, Central Salt & Marine Chemicals Research Institute (Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi), Bhavnagar, Gujarat 364002, India b National Research Center for Groundnut, Junagadh, Gujarat, India c Plant Molecular Biology Division, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, New Delhi 110067, India Diajukan Kepada Program Studi Bioteknologi Fakultas Sekolah Pasca Sarjana Universitas Gadjah Mada pada Tanggal 19 April 2013 untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Rekayasa Genetika

KELOMPOK DUA - Muhammad Yusro 12/338637/PMU/07365 - Diana Larasati G 12/338669/PMU/07367 - Sri Lestari 12/338674/PMU/07368 - Nur Rohmah 12/338710/PMU/07375 - Weny Widya N 12/338720/PMU/07378 Ratih Feraritra 12/338744/PMU/07385 Dinihari Indah K. 12/338855/PMU/07399 Lusty Istiqomah 12/338752/PMU/07387 Arung Desah P 12/338787/PMU/ 07391 - Medina Uli Alba S 12/338866/PMU/07404

LATAR BELAKANG Alternative renewable energy sources MAHAL LANGKA BIOFUEL J. CURCAS Lebih fleksibel (biaya, perawatan & produksi) dapat ditanam di berbagai jenis lahan Agrobacterium-mediated genetic transformation Transgenik yang tahan atau toleran terhadap cekaman biotik atau abiotik Stres biotik maupun abiotik membatasi potensi hasil

Agrobacterium Tumefaciens Teknik rekayasa genetika Agrobacterium tumifaciens Metode transfer gen yang paling banyak digunakan untuk perbaikan sifat tanaman Mudah Efektivitas biaya Transgen re-arrangement relatif rendah Mampu mentransfer segmen DNA yg panjang

Studi Terkini Menggunakan ekplan dari kotiledon Penelitian selama 2 dekade telah gagal membuat suatu protokol regenerasi J. circas secara in vitro Menggunakan ekplan dari kotiledon Efisiensi transformasi rendah Menghasilkan variabilitas genetik Menghilangkan karakteristik tanaman target Mengekplorasi kemungkinan regenerasi tanaman melalui direct organogenesis dari ekplan daun Mengoptimalkan beberapa parameter penting untuk memaksimalkan efisiensi transformasi

BAHAN DAN METODE Plant material Strain Agrobacterium dan vektor plasmid Determinasi level fitotoksik dari antibiotik Transformasi Evaluasi parameter transformasi Analisis transforman Analisis molekuler Multiplikasi dan pembuatan tanaman transforman

Plant material Kultur tunas J. curcas (umur 3-4 tahun) Disayat (3–4 cm) Sterilisasi (HgCl, 15 menit) dan dicuci Kultur (15 ml medium agar) 4 minggu  diambil tunas sebagai eksplan Regenerasi eksplan ke medium pH 5,7; 25±2◦C under a 16/8 h (day/night) Fotoperiod dengan white fluorescent lamps

pCAMBIA1304 T-DNA cassette. Strain Agrobacterium dan vektor plasmid pCAMBIA1304 T-DNA cassette. - CaMV35S 35S promoter from cauliflower mosaic virus; S-DREB2A, sense-dehydration responsive element binding protein gene GUS, -glucuronidase gene Agrobacterium strain LBA 4404  YMB medium, pada kondisi gelap 28ºC

DETERMINASI LEVEL FITOTOKSIK ANTIBIOTIK Higromycin 0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 50 µg/ml Cephalexin 250, 500, 750, 1000 µg/ml Cefotaxime Carbenicilin

TRANSFORMASI + co-kultivasi Eksplan daun Single cell koloni Agrobacterium dicuci air destilasi + 500 g/ml cefotaxime Blotted dry pada kertas steril Ditumbuhkan di medium YMB 25gml/1 hygromycin Tumbuhkan pada ruang gelap (16-18 h, 28ºC, 180 rpm) MS garam, 3% sukrosa 2.27 M TDZ 500 g/ml cefotaxime Transfer ke medium regenerasi tunas (0.7% agar-solidified) Sentrifugasi (6000 rpm, 10min) 4 minggu Cefotaxime 5 µg/ml hygromycin Pelet sel dicuci dengan YMB cair (2x) Kepadatan sel bakteri 109 sel/ml Eksplan disubkulturkan pada medium segar + Suspensi Agrobacterium Eksplan daun 4 minggu Blotted dry pada kertas steril Tunas resisten hygromycin disubkulturkan Transfer ke medium regenerasi tunas (- hygromycin)

HASIL & PEMBAHASAN Regenerasi bakal tunas Tunas dapat dihasilkan dari ekplan daun (10–12 tunas/eksplan) Evaluasi pengaruh antibiotik terhadap eksplan dan kultur tunas Antibiotik hygromycin efektif pada konsentrasi rendah (2.5 µg/ml) Tiga antibiotik lainnya (sporidex, carbenicillin, dan cefotaxime) eliminasi Agrobacterium 500 g/ml cefotaxime paling efektif mengeliminasi bakteri

Hygromycin resisten pada tunas transforman Tunas dapat tumbuh dari ekplan daun (10–12 tunas/ekplan) tanpa adanya Agrobacterium pada medium rendah hygromycin Ekplan tidak dapat tumbuh menjadi tunas pada medium yang ditambahkan 5 µg/ml hygromycin (kontrol negatif) Ekplan yang dikultivasi dengan Agrobacterium menghasilkan 3–4 tunas per ekplan dan 20–30% memberikan respon positif terhadap medium mengandung hygromycin Induksi tunas adventif dari tunas daun yang tidak diinfeksi Agrobacterium Ekplan daun yang diinfeksi Agrobacterium Seleksi tunas adventif pada medium mengandung hygromycin

Ekspresi GUS pada tunas transforman GUS-positif warna biru dapat dideteksi secara visual pada seluruh jaringan tanaman transgenik (pewarnaan dengan reagen X-gluc Tidak adanya warna biru pada jaringan non-transforman Eksplan daun Non transforman Blue GUS spot pada ekplan daun transforman

Tabel 1. Pengaruh berbagai parameter terhadap transformasi (%) pada eksplan daun J. curcas.

Karakterisasi Molekuler dan Tanaman Transforman (a) Analisis PCR untuk mendeteksi gen GUS (400 bp) (b) Analisis PCR untuk mendeteksi gen S-DREB2A (866 bp) pada tanaman transgenik. Lanes: M molecular size marker (100 bp ladder) 1 kontrol negatif (tanaman non-transgenik) 2 kontrol posiftif (plasmid DNA) 3–12 tanaman transgenik (c) Analisis DNA gel blot hibridasasi pada tanaman transgenik Lanes: 1 plasmid DNA 2 tanaman non-transgenik 3–7 tanaman transgenik Genomik DNAs dipotong oleh HindIII dan dihibridisasi pada S-DREB2A probe.

Multiplikasi dan Pengembangan Tanaman Transforman Hanya tunas yang berasal dari line transgenik secara konsisten menunjukkan hasil amplifikasi PCR (+) dan hibridasasi DNA gel blot (+) Tunas (0,3-0,5 cm) ditransfer kedalam media pemanjangan tunas, Sekitar 40% akan tumbuh akar Setelah 6-8 minggu 50-60% tanaman berhasil diaklimatisasi dan ditanam ke tanah Multiplikasi dari tanaman resisten hygromycin Pemanjangan tunas Perakaran Aklimatisasi

KESIMPULAN Protokol menggunakan Agrobacterium-mediated genetic transformation dan regenerasi tanaman J. curcas menggunakan eksplan daun telah berhasil dilakukan

SEKIAN DAN TERIMA KASIH

Evaluasi faktor-faktor yang mempengaruhi transformasi PARAMETER : 1. Lama periode prekultur 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, atau 7 hari 2. Fase pertumbuhan bakteri Nilai OD 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8, atau 1.0 pada 600 nm 3. Durasi infeksi 10, 20, atau 30 menit 4. Metode perlukaan (wounding) Glass bead, manual pricking, non-wounding 5. Lama periode co-kultivasi 6. pH medium co-kultivasi 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, atau 6.0 7. Konsentrasi acetosyringone 50, 100, 200, atau 400 M Senyawa phenol acetosyringone Dilarutkan dalam etanol Stok volume dengan air destilasi yang diautoklaf Alikuot ditambahkan ke medium regenerasi ANALISIS DATA : Rancangan percobaan (RAL)  analisis ANOVA Perbedaan diantara rataan  Duncan’s multiple range test (SPSS ver 7.5) Evaluasi dan optimasi berdasarkan tunas yang bertahan hidup pada medium selektif Ekspresi gen penanda dan positif dengan PCR

Analisis Transforman Histochemical GUS Assay Jaringan daun tanaman tranforman Jaringan daun tanaman non tranforman 100mM sodium phosphatase 1mM EDTA 0,5 mM potassium ferricyanide 0,5 mM triton X-100 1 mM X-gluc Inkubasi (1 malam, 37ºC) pada larutan X-gluc Klorofil dihilangkan (dicuci 70% alkohol) Ekspresi GUS (mikroskop stereo-zoom)

Molekuler Analisis PCR dan Karakterisasi DNA gel blot hibridisasi Isolasi DNA Daun muda 50g of genomic DNA Inkubasi (1 malam, 37ºC) dengan HindIII (10 units/g of DNA) Tanaman transforman Tanaman non transforman Separasi (0.8% gel agarose Gen GUS : 5-GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG-3 5-TGGATCCCGGCATAGTTAAA-3 Amplifikasi PCR (gen S-DREB2A dan GUS) Thermal cycler DNA blotted (muatan positif) Hybond N membrane Gen S-DREB2A : 5-GATCCCTCGAGATGGAGCGGGGGGAGGG-3 5-TCCGAGGTACCCTAATAGGAGAAAAGGCTA-3 Elektroforesis cross-linked ke membran oleh UV irradiation Gel didokumentasikan dengan gel documentation system (Syngene, USA) Hybridisasi ke AlkPhos Non-radioaktif yang dilabel DNA probe

Molekuler Analisis 15 µl PCR reaction mixture Amplifikasi 50 ng DNA 15 µl PCR reaction mixture Amplifikasi Inisiasi Denaturasi 94°C selama 4 menit, 35 siklus 94°C selama 30 detik Primer annealing 55° selama 1 menit Extension 72°C selama 1 menit Final Extension 72°C selama 1 menit 10 mM TRIS-HCL (pH 9) 50 mM KCL 0,1% 0,2 mM/ dntp 3,0 mM MgCl2 0,4 primer 1 unit Taq DNA polimerase S-DREB2A (866 BP) Gus (400 bp) Gel Elektroforesis 1,5% agarose 1 x TAE buffer, 80 V selama 45 menit Stained: 0,5 µg/ml ethidium bromide selama 10 menit

Vektor pCAMBIA