Skrining, Isolasi dan Pengawetan Mikroorganisme

Pendahuluan Meskipun teknologi DNA rekombinan telah meningkatkan produksi berbagai produk fermentasi, pencarian mikroorganisme baru dari alam yang memiliki potensi untuk menghasilkan produk tertentu masih tetap di eksploitasi.

Prescott et al. (2002) Industrial Microbiology and Biotechnology.

Prescott et al. (2002) Industrial Microbiology and Biotechnology.

Koleksi kultur murni

Mengapa harus mengkarakterisasi isolat mikrobial? Memastikan taksonomi yang tepat untuk menentukan metode pengawetan yang tepat. Menguji ketepatan metode pengawetan yang digunakan dan dapat melakukan modifikasi serta memperbaiki prosedur pengawetan. Untuk mempermudah monitorinig stabilitas jangka panjang mikroorganisme tersebut.

Tujuan Skrining mikroorganisme Skrining mikroorganisme dilakukan untuk: Mendeteksi produk baru (metabolit, vitamin, enzim) serta potensi kegunaan ekonomis lainnya seperti: Kontrol biologis Biodegradasi Bioremediasi Proses Kimiawi (biotransformasi, bioakumulasi) Pangan dan pemrosesan pangan Pengembangan uji

Metode dalam isolasi mikroorganisme Metode kualitatif (Pengamatan, Mikroskopi) Metode kuantitatif (Kecepatan pertumbuhan, kapasitas sporulasi) Metode Biokimiawi (kromatografi, uji enzimatis, analisis protein) Metode molekular (PCR, Sekuensing)

Metode Kualitatif Morfologi dan anatomi kultur Studi anatomi (bentuk dan ukuran spora, kloroplas, organisasi intraselular) Morfologi kultur (pigmentasi, radius koloni, pembentukan hifa dan agregasi, penampakan total) Sporulasi (kelimpahan, jenis) Pergerakan (nematoda dan organisme yang berflagela)

Morfologi kultur tiga spesies Monilina (A) Monilinia laxa; (B) M. fructicola; (C) M. fructigena

Morfologi kultur tiga spesies Monilina Catatan: Penentuan berdasarkan morfologi kultur  mudah dan murah, tapi memerlukan isolat murni dan memerlukan waktu yang lama.

Metode Kualitatif (Lanj.) Mikroskopi Analisis morfologi, anatomi, dan organisasi intraselular Deteksi senyawa biokimia dan struktur makro dengan teknik staining (pewarnaan) Identifikasi menggunakan oligonukleotida dari organisme dengan pewarna spesifik Penentuan viabilitas

Morfologi Bakteri

Penentuan viabilitas ragi dengan pewarnaan metilen violet

Metode-metode mikroskopi SEM TEM Mikroskop cahaya Fluorescence Microscopy

Metode Kuantitatif Laju Pertumbuhan (bakteri, jamur, alga) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Laju fotosintesis (alga dan bakteri fotosintetik) Laju respirasi Produksi enzim / penggunaan substrat

Laju Pertumbuhan Laju pertumbuhan mikroorganisme (bakteri, ragi, jamur, alga) dapat ditentukan dengan cara: Penghitungan jumlah sel (mis.: hemasitometer) Kerapatan Optis pada 600 nm CFU Berat kering sel

Penghitungan jumlah sel dengan hemasitometer Untuk sel yang dihitung di kotak A, B, C, D: Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang dihitung × 104 × fp Untuk sel yang dihitung di kotak kecil di kotak E: Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang dihitung × 2,5 × 105× fp

CFU

Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme Rao, D.G. (2005). Introduction to Biochemical Engineering. McGraw Hill.

Kromatografi lapis tipis Untuk menentukan jumlah metabolit (bakteri, jamur, ragi) atau senyawa lain (misal: klorofil pada alga)

Produksi enzim / Penggunaan Substrat Riffel, A. & A. Brandelli. (2006). Braz. J. Microbiol. 37 (3): 

Produksi enzim / Penggunaan Substrat Plate 1 & 2 memiliki aktivitas ligninilitik  menunjukkan bahwa mikroorganisme pada plate 1 & 2 memiliki kemampuan untuk memetabolisme lignin.

Mikroorganisme yang ditumbuhkan pada media dengan sumber nitrogen berbeda Dari kiri ke kanan: Urea Hipoksantin Nitrit Nitrat

Metabolit Primer Metabolit primer: senyawa yang sangat penting untuk hidup dan reproduksi sel, dan metobolisme primer berlangsung hampir sama pada semua mikrorganisme

Metabolit sekunder Setiap metabolit sekunder dibentuk oleh sedikit mikroorganisme Metabolit sekunder tidak esensial untuk pertumbuhan dan reproduksi Pembentukannya sangat bergantung pada kondisi lingkungan Beberapa metabolit sekunder dihasilkan dengan struktur yang sangat berhubungan Beberapa mikroorganisme menghasilkan berbagai golongan senyawa sebagai metabolit sekunder Pengaturan biosintesis metabolit sekunder sangat berbeda dengan biosintesis metabolit primer

Metabolit Primer Vs Metabolit sekunder Metabolisme sekunder dapat dimodifikasi tanpa mengganggu metabolisme primer. Modifikasi genetik yang menyebabkan modifikasi metabolit sekunder diharapkan tidak mengganggu fungsi sel. Crueger & Crueger. 1989. Biotechnology. Sinauer Associates.

Isolasi Mikroorganisme Isolasi mikroorganisme dilakukan untuk memperoleh kultur murni ataupun campuran yang kemudian diuji untuk menentukan isolat mana yang menunjukkan reaksi atau produk yang diinginkan. Dalam beberapa kasus, dimungkinkan pada tahap isolasi, mikroorganisme yang diinginkan dapat dikenali.

Isolasi Mikroorganisme (Cont.) Kriteria penting untuk pemilihan mikroorganisme: Karakteristik nutrisi dari mikroorganisme Suhu optimum mikroorganisme Reaksi organisme dengan alat yang akan digunakan dan kesesuaian organisme dengan jenis proses yang akan digunakan Stabilitas mikroorganisme dan kemudahan untuk manipulasi genetik Produktivitas mikroorganisme Kemudahan untuk memperoleh produk dari kultur

Pengayaan pada media cair Dilakukan dalam labu kocok Pertumbuhan inokulum campuran akan menyebabkan modifikasi media  mengubah kekuatan seleksi media  dilakukan beberapa kali sub-kultur pada media baru.

Pengayaan pada media cair Waktu pemindahan menentukan keberhasilan isolasi, namun tidak selalu mikroorganisme dengan kecepatan tumbuh spesifik tertinggi adalah yang diinginkan. Mikroorganisme yang diinginkan adalah organisme yang memiliki afinitas tertinggi terhadap substrat pembatas. Substrat pembatas: substrat dalam medium yang konsentrasinya mempengaruhi pertumbuhan sel dan mengubah fase pertumbuhan dari fase log ke fase stasioner dan akhirnya ke fase kematian.

Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan pertumbuhan spesifik mikroorganisme Stanbury ,P.F. et al. (2003). Principles of Fermentation of Technology. Butterworth-Heinemann

Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan tumbuh spesifik mikroorganisme A dan B Stanbury ,P.F. et al. (2003). Principles of Fermentation of Technology. Butterworth-Heinemann

Pengayaan kultur pada media padat Media padat pada umumnya digunakan untuk isolasi mikroorganisme yang menghasilkan enzim tertentu. Pada teknik ini, digunakan media selektif yang mengandung substrat enzim yang diinginkan, yang pada akhirnya mendorong pertumbuhan mikroorganisme yang menghasilkan enzim yang diharapkan.

Skrining mikroorganisme yang diinginkan Metode Pengayaan Jenis isolat Nilai pH yang ekstrim (pH 4-2) Asidofilik Suhu yang rendah (4-15°C) Psikotrof Suhu tinggi (42-100°C) Termofilik Konsentrasi NaCl yang tinggi Halofilik Atmosfir N2 Anaerobik Kitin sebagai substrat pertumbuhan Lysobacter Kulit batang pohon, akar Myxobacteria Butiran pollen Actinoplanes Crueger & Crueger. 1989. Biotechnology. Sinauer Associates.

Sistem uji untuk skrining metabolit Produk yang diinginkan Sistem uji antibiotik Plat agar dengan mikroorganisme uji. Terbentuknya zona bening digunakan sebagai indikator. Resistensi terhadap antibiotik β-laktamase Plat agar yang telah ditambah β-laktamase. Protease Plat agar dengan kasein, pemilihan koloni yang menghasilkan zona bening. Amilase Plat agar dengan pati, pemilihan koloni setelah pewarnaan dengan iodin. Lipase Plat agar dengan emulsi minyak, pemilihan koloni setelah pengendapan asam lemak bebas dengan ion Ca2+. Fosfatase Plat agar dengan fenolftalein-difosfat dan indikator pH. Seleksi berdasarkan perubahan warna NAD Plat agar dengan mikroorganisme auksotrof terhadap NAD.

Pengawetan Mikroorganisme Penyimpanan harus dilakukan sedemikian hingga: Menghilangkan perubahan genetik Melindungi dari kontaminasi Mempertahankan viabilitas

Pengawetan mikroorganisme Penyimpanan pada suhu rendah Penyimpanan pada slope agar kultur ditumbuhkan pada slop agar dan dapat disimpan pada lemari pendingin (4°C) atau frezer (-20°C), dan disub kultur setiap 6 bulan sekali Penyimpanan pada nitrogen cair aktivitas mikroorganisme sangat minim pada suhu sangat rendah (-150 sampai -196°C), yang dapat dicapai dengan penyimpanan pada nitrogen cair. Pada penyimpannnya, mikroorganisme disuspensikan dalam agen krioprotektif (mis.: gliserol 10%)

Pengawetan mikroorganisme Penyimpanan dalam bentuk dehidrasi Kultur kering Tanah yang lembab dan steril diinokulasi dengan kultur dan diinkubasi selama beberapa hari agar mikroorganisme tumbuh, kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Tanah kering disimpan pada suhu ruang atau 4°C. MO dapat bertahan sampai 20 th dengan viabilitas 50%. Liofilisasi liofilisasi atau pengeringan beku dilakukan dengan membekukan kultur dan dikeringkan pada keadaan vakum, sehingga mengakibatkan sublimasi air dari sel. Pada proses pengeringan, harus ditambahkan pelindung seperti susu, serum, atau natrium glutamat,