KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP atggagaaccgtgctgttccaaacactggtgataatggtggtcgccgcaatcctctggttagaccgttagatgattgcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgatccaacatctatcattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggatactattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactcttaccttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttctgcaggcgaataatcggtgagacccagatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggccattgtaaaccaagggacctcagttaaagcagccggtaataacagtcttgaaaattactttgaggtagatggcgcgagatttaagtgcaaaactccggatttgataaatgaggttagacccaaaatggccgatgttccaaacgctatacgtcggtacgccaggagtcatgaaaagattattcaggactttatcaactccggtcttataaagcctgattatcatttacaattcaaacatggcgtattaccaagccatgtgtttggtaccggcgattatataaatggttcgttgatgaatatctcagatgatcaacttatctcgaacctgcttatgaaaagaaacgctttgtgcaagggtaacgagggcaaggaactgtacaacgttaaccagcttgcatcgataactggttgctaa 5’ terminus atggagaacagtgccgttgcaaac BamHI(GGATCC) and extra sequence AATTAA GGATCC ATGGAGAACAGTGCCGTTGCAAAC ToCV-CP-F-Bam AATTAAGGATCCGAGAACAGTGCCGTTGCAAAC   3' terminus tacaacgttaaccaacttgcatcgataactggttgctaa complementary TTAGCAACCAGTTATCGATGCAAGTTGGTTAACGTTGTA TTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG HindIII(AAGCTT) and extra sequence AATTAA AAGCTT TTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG ToCV-CP-R-Hin AATTAAAAGCTTTTAGCAACCAGTTATCGATGCAAG

KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP around multiple cloning site in pQE30 CATCACCATCACCATCACGGATCCGCATGCGAGCTCGGTACCCCGGGTCGACCTGCAGCCAAGCTT   CATCACCATCACCATCACGGATCCatggagaacagtgccgttgcaaacactggtgataacggtggtggccgcaatcctctggttagaccgttagatgatggcgtagatgacgaggtgcagaacttgggcaggagggacgattcgacatctctcattccggctaatcctaatcgatcttccagttgggctttgttgaacccggatactattaattataacgagttaaggaaattgaaggtacactccactaggggtgatactcttaccttgactcaggaagaggagttcgagaagatactcgaatccttttgcaggcgaataatcggtgaaaccccgatgacggataagattttcgctggtttctacatgtctatgtgtcaggccattgtaaaccaagggacctcagttaaagcagccggtaataacagtcttgaaaactactttgaggtagatggtgcgagatttaagtggaaaactccggatttgataaatgaggttagacccaaaatgtccgatgttccaaacgctatacgtcggtacgccagaagtcatgaaaagattattcaggactttatcaactccggtcttattaagcctgattatcatttacaattcaaacatggcgtattgccaagccatgtgtttggtaccggcgattatataaatggttcgttgatgaatatctcagatgatcaacttatctcgaacctgcttatgaaaagaaacgctttgtgcaagggtaacgagggcaaggaactgtacaacgttaaccaacttgcatcgataactggttgctaaAAGCTT Frame 1 HHHHHHGSMENSAVANTGDNGGGRNPLVRPLDDGVDDEVQNLGRRDDSTSLIPANPNRSSSWALLNPDTINYNELRKLKVHSTRGDTLTLTQEEEFEKILESFCRRIIGETPMTDKIFAGFYMSMCQAIVNQGTSVKAAGNNSLENYFEVDGARFKWKTPDLINEVRPKMSDVPNAIRRYARSHEKIIQDFINSGLIKPDYHLQFKHGVLPSHVFGTGDYINGSLMNISDDQLISNLLMKRNALCKGNEGKELYNVNQLASITGC*

KONSTRUKSI PLASMID REKOMBINAN pQE30+CP[ToCV] UNTUK EKSPRESI PROTEIN CP ToCV CP gene

EKSPRESI GEN CP ToCV DALAM SEL E. coli M15[pREP4] Sel kompeten E. coli M15[pREP4] diletakkan di atas es selama 5 min sampai cair Sekitar 100 µl sel kompeten E. coli M15[pREP4] ditransfer ke dalam tabung mikro, ditambahkan plasmid kimera pQE30+ToCV-Cpgene, segera diletakkan di atas es selama 10 min Siapan diberikan perlakukan kejut panas (heat-shock) pada 42oC selama 45 s/d 50 min, segera diletakkan di atas es selama 2 min Ditambahkan 900 µl SOC µl medium, diinkubasi dengan goyangan (shaking) pada 37oC selama 60 min, kemudian 100 µl siapan ditanam pada medium padat yang mengandung antibiotika

SCREENING KOLONI E. coli M15[pREP4] YANG MENGANDUNG PLASMID pQE-30+CP[ToCV] Pemotongan dengan BamHI + HindIII PCR dengan primer untuk gen CP ToCV