Struktur dan kinetika enzim VII. Fungsi protein I Struktur dan kinetika enzim

Fungsi protein Enzim  Fokus studi Protein transport Nutrien Contoh: Hemoglobin (transport oksigen) Nutrien Contoh: Ovalbumin (protein telur), kasein (protein susu) Gerak mekanis (fungsi otot) Contoh: actin dan myosin Struktural Contoh: rambut, jaring laba-laba, kolagen Pertahanan Contoh: antibodi Regulator Contoh: Insulin

Enzim Enzim adalah katalis reaksi-reaksi sistem biologi. Sebagian besar enzim adalah protein. Karakteristik dari enzim adalah catalitic power dan spesifisitas.

Efek katalis Fraksi molekul Energi potensial H EK Koordinat reaksi Lintasan tanpa katalis Ea reaksi Tanpa katalis Lintasan dengan tambahan katalis Fraksi molekul Reaktan Energi potensial Ea H EK Produk Ea reaksi dengan katalis Koordinat reaksi

Apa yang dilakukan katalis? Karena Go‡= Ho‡ ToS‡, maka yang menyebabkan reaksi berlangsung lambat adalah karena nilai Go‡ yang besar dan positif. Hal ini dapat disebabkan oleh: keperluan energi yang besar untuk mencapai keadaan teraktivasi (Ho‡ besar dan positif). Rendahnya peluang untuk mencapai keadaan teraktivasi dan juga terjadinya pengekangan struktur pada keadaan teraktivasi (So‡ besar dan negatif). Peran katalis: mengikat dan mengorientasikan molekul-molekul reaktan menjadi keadaan intermediet yang mirip dengan keadaan transisi. Melalui jalur reaksi ini akan terbentuk dua energi aktivasi yang lebih rendah, dimana keadaan intermediet merupakan minimum kedua energi aktivasi terebut.

Apa yang dilakukan katalis? reaktan G‡1(A  A*) GA katalis Energi bebas, G G‡2(A*  B) Keadaan intermediet (A*) GB Koordinat reaksi A A* B k1 k2

Bagaimana enzim mempercepat reaksi? Menurut teori keadaan transisi, reaksi kimia konversi substrat (S) menjadi produk (P) harus melalui keadaan transisi (S‡) yang memiliki energi bebas lebih tinggi dibanding S dan P. Beda energi bebas keadaan transisi dan substrat disebut energi bebas aktivasi atau energi aktivasi (G‡). G‡ = G(S‡) – G(S) Enzim mempercepat reaksi dengan cara memfasilitasi pembentukan keadaan transisi.

Pembentukan kompleks ES adalah tahap pertama katalisis enzim Bukti pembentukan ES dalam reaksi yang dikatalisis enzim: Reaksi yang dikatalisis oleh enzim memiliki kecepatan maksimum. Bukti struktur kompleks ES oleh difraksi sinar-X. Adanya karakteristik spektrum dari kompleks ES. G‡ (cat) G‡ (uncat) ‡ ES S P Energi bebas, G Koordinat reaksi

Pembuktian pembentukan kompleks ES dari profil kecepatan reaksi Pada reaksi yang dikatalisis enzim, penambahan konsentrasi substrat akan mencapai suatu kondisi dimana kecepatan reaksi tidak bertambah lagi (kecepatan maksimum). Adanya kondisi jenuh ini secara tak langsung menunjukan adanya pembentukan kompleks ES terlebih dahulu dalam reaksi yang dikatalisis enzim.

Pembuktian pembentukan kompleks ES dari difraksi sinar-X

Struktur pusat aktif Pusat kegiatan katalitik enzim terdapat pada pusat aktif. Pusat aktif enzim adalah daerah yang mengikat substrat (dan kofaktor bila ada) dan juga daerah katalitik mengandung residu-residu yang langsung berpartisipasi dalam pembentukan dan pemutusan ikatan. Interaksi enzim dan substrat pada pusat aktif mempromosikan pembentukan keadaan transisi. Oleh karena itu, pusat aktif adalah daerah dalam enzim yang secara langsung menurunkan G‡ reaksi sehingga meningkatkan laju karakteristik dari enzim. CS BS BS = binding site CS = catalitic site

Karakteristik struktur pusat aktif enzim Pusat aktif enzim adalah celah sempit (cleft) dengan volume total relatif kecil yang dibangun oleh residu-residu yang mungkin berjauhan. Lisozim

Karakteristik struktur pusat aktif enzim Daerah pengikatan substrat pada pusat aktif sebagian besar dibangun oleh residu-residu nonpolar. Pengikatan substrat berlangsung melalui multi interaksi lemah.

Spesifisitas enzim Karakteristik dari enzim adalah memiliki aktivitas spesifik. Spesifisitas enzim disebabkan oleh interaksi yang akurat antara substrat dan enzim. Akurasi tinggi ini disebabkan oleh struktur 3D dari protein enzim. Menurut kespesifikan aktivitasnya, enzim dibagi menjadi: Spesifik grup: enzim dapat beraksi pada beberapa substrat tetapi saling berkaitan. Contohnya alkohol dehidrogenase. Enzim ini dapat mengkatalisis reaksi oksidasi berbagai macam alkohol. Absolut grup: enzim hanya beraksi pada satu substrat saja. Contohnya glukokinase. Enzim ini hanya mentransfer fosfat dari ATP ke glukosa dan bukan ke gula yang lain.

Spesifisitas katalis enzim

Hipotesa Lock and Key Fischer 1890 menyarankan bahwa kespesifikan enzim berarti adanya daerah struktur yang komplemen antara enzim dan substrat: substrat akan menempati sisi komplemennya yang pas pada enzim seperti layaknya pasangan kunci dan anak kuncinya. CS BS RG BG + BG Substrat enzim kompleks enzim-substrat BS = binding site CS = catalitic site BG = binding group RG = reacting group

Hipotesa Induced Fit Kelemahan mekanisme lock-and-key yaitu tidak memperhatikan fleksibilitas molekul protein. Hasil analisis difraksi sinar-X dan NMR menunjukkan adanya perbedaan struktur enzim bebas dan enzim yang mengikat substart. Artinya pengikatan suatu substrat pada enzim dapat menyebabkan perubahan konformasi. Berdasarkan hal di atas Koshland di tahun 1958, menyarankan bahwa struktur dari substrat mungkin komplemen dengan struktur pusat aktif di dalam kompleks enzim-substrat tetapi tidak dalam keadaan bebas: perubahan struktur terjadi selama proses pengikatan substrat hingga terjadi kesesuaian antara keduanya.

Hipotesis induced Fit RG BG CS BS + CS BS BG Glukosa Heksokinase

Kinetika reaksi enzim

Kinetika Michaelis Menten k1 kcat E + S  ES  E + P k1 Asumsi reaksi kebalikan antara E dan P di abaikan. Sehingga V = kcat [ES] Asumsi kesetimbangan antara enzim dan substrat: analisis Michaelis Menten Leonor Michaelis dan Maude Menten (1913) mengasumsikan bahwa laju disosiasi bila diukur berdasarkan nilai kcat terlalu lambat dibandingkan dengan laju pembentukan (k1) dan redisosiasi menjadi kompleks enzim-substrat menjadi enzim dan substrat (k1). Bila hal ini terjadi, ES akan selalu mendekati kesetimbangan dengan E dan S.

Kinetika Michaelis Menten

Kinetika Briggs-Haldane Asumsi Michaelis-Menten yang menyatakan bahwa laju pembentukkan produk sangat lambat dibandingkan reaksi pembentukkan kompleks ES dan redisosiasinya, tidaklah selalu benar karena sebagian besar kompleks ES selalu berlanjut membentuk produk sehingga nilai kcat > k1. Briggs-Haldane di tahun 1925 mengemukakan model dengan argumen bahwa: semakin banyak ES yang terbentuk semakin cepat ia akan terdisosiasi membentuk produk; oleh karena itu konsentrasi ES akan tetap konstan atau steady state. Keadaan ini akan terus berlangsung hingga seluruh substrat habis bereaksi.

Kinetika Briggs-Haldane

Kenetika Briggs-Haldane

Menentukan nilai Vmax dan KM Nilai KM dapat diperoleh dari grafik dengan ekstrapolasi ke sumbu [S] saat V = ½ Vmax. Vmax V ½ Vmax KM [S]

Plot Lineweaver-Burk Penentuan nilai KM dan Vmax langsung dari grafik persamaan Michaelis-Menten tidaklah selalu memuaskan karena grafiknya membentuk kurva sehingga menyulitkan untuk melakukan ekstrapolasi dengan akurat. Lineweaver dan Burk (1934) menyelesaikan masalah di atas dengan cara mereformulasi persamaan Michaelis-Menten ke dalam bentuk persamaan linier. 1/V Titik potong = - 1/KM Slope = KM /Vmax Titik potong = 1/Vmax 1/[S]

Plot Eadie-Hofstee Kelemahan dari plot Lineweaver-Burk adalah ekstrapolasi untuk menentukan nilai 1/KM seringkali terlalu panjang sehingga penentuannya menjadi tidak akurat. Untuk mengatasi masalah di atas Eadie-Hofstee melakukan perubahan pada persamaan Lineweaver-Burk dengan mengalikan kedua sisi persamaan tersebut dengan V.Vmax sehingga: Vmax Slope = -KM V Vmax /KM V / [S]

Arti nilai KM KM adalah konsentrasi substrat dimana setengah dari populasi pusat aktif enzim terisi penuh. Bilai nilai KM diketahui, maka fraksi pusat aktif yang mengikat substrat (fES) pada berbagai konsentrasi substrat diberikan oleh

Arti nilai KM KM menyatakan tetapan disosiasi kompleks ES, bila kcat << k-1. Nilai KM yang kecil menunjukan kuatnya pengikatan S oleh E. Nilai KM yang besar menunjukan lemahnya pengikatan S oleh E.

Arti kcat kcat sering disebut juga turnover number dari suatu enzim, menyatakan jumlah molekul substrat yang dikonversi menjadi produk dalam suatu satuan waktu oleh satu molekul enzim saat jenuh dengan substrat. kcat = Vmax/[E]o

Arti nilai KM dan kcat Pada kondisi [S] << KM, dan sebagian besar enzim dalam keadaan bebas, sehingga [E]  [E]0, maka Pada kondisi di atas rasio kcat /KM seperti tetapan laju orde pertama untuk interaksi antara E dan S. Rasio kcat /KM juga menyatakan efisiensi katalitik. Nilai yang besar dari kcat (rapid turnover) atau nilai kecil dari KM (high affinity for substrate) akan membuat nilai kcat/KM menjadi besar. Rasio kcat /KM untuk substrat yang berbeda digunakan sebagai ukuran spesifisitas dari enzim.

Rasio kcat / KM untuk aktivitas kimotripsin terhadap berbagai substrat

Batas efisiensi katalitik enzim Bila laju pembentukan produk (kcat) jauh lebih cepat dari laju disosiasi ES (k-1), maka kcat/KM ≅ k1. Batas atas nilai kcat/KM adalah k1  Laju katalitik tidak bisa lebih cepat dari pada laju difusi untuk mempertemukan enzim dengan substrat. Karena batas tertinggi laju pembentukan ES (k1) adalah 108 – 109 s-1 M-1, maka batas atas untuk kcat/KM juga pada rentang ini. Enzim yang memiliki rasio kcat/KM mendekati 108 – 109 s-1 M-1 dikatakan telah mencapai kesempurnaan kinetika.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kinerja enzim Temperatur Konsentrasi ion hidrogen (pH) Konsentrasi substrat

Efek Temperatur Secara umum kenaikan temperatur akan meningkatkan energi kinetik dan frekwensi tumbukan dari molekul-molekul reaktan sehingga akan meningkatkan laju reaksi baik yang dikatalisis maupun tidak. Setiap kenaikan 10 oC, laju reaksi naik kira-kira 2 kali. Tetapi, karena enzim adalah protein, kenaikan temperatur juga akan meningkatkan energi kinetik dari enzim hingga melampaui batas energi untuk memutus interaksi non-kovalen yang menjaga struktur 3D enzim. Enzim akan mengalami denaturasi dan kehilangan aktivitasnya.

Efek konsentrasi ion hidrogen Protein enzim memiliki asam-asam amino yang dapat diprotonasi/ dideprotonasi, sehingga konformasi dan aktivitas enzim akan dipengaruhi oleh konsentrasi ion hidrogen di dalam larutan enzim.

Pengaruh pH pada aktivitas enzim

Efek konsentrasi substrat

Koenzim, vitamin dan ion logam Fungsi koenzim Contoh mekanisme katalisis yang dibantu koenzim

Fungsi Koenzim Sebagian proses biologis memerlukan fungsi katalitik diluar yang disediakan oleh molekul protein. Dalam hal ini, protein memerlukan bantuan beberapa molekul kecil lain atau ion untuk melakukan reaksi. Molekul/ion tersebut terikat pada enzim sehingga disebut kofaktor. Kofaktor dapat berupa ion anorganik, seperti Fe2+, Mg2+, dan Zn2+, atau berupa senyawa organik atau metaloorganik yang dikenal dengan koenzim. Koenzim yang terikat secara kovalen disebut gugus prostetik. Enzim aktif yang lengkap mengikat kofaktor disebut holoenzim. Bagian protein dari holoenzim disebut apoenzim atau apoprotein.

Karbonik anhidrase-2 Pusat aktif enzim CA2 Struktur enzim CA2 OH- Zn2+ His 119 His 94 His 96 Struktur enzim CA2

Mekanisme katalitik enzim karbonik anhidrase-2 C

UDP-galaktosa epimerase

Koenzim atau substrat kedua? Enzim-enzim dehidrogenase, seperti alkohol dehidrogenase, masing-masing memiliki sisi pengikatan yang kuat untuk koenzim NAD+ (bentuk teroksidasi). Setelah reaksi oksidasi berlangsung, NADH (bentuk tereduksi) yang terbentuk meninggalkan enzim, dan kemudian dioksidasi kembali dalam sistem aseptor elektron di dalam sel. NAD+ yang terbentuk kemudian dapat mengikat enzim lain, dan siklus kemudian berulang. Dalam kasus di atas, NAD+ lebih mirip seperti substrat kedua, tetapi karena selalu dipulihkan ke bentuk teroksidasi oleh sistem sel secara terus menerus, maka NAD+ / NADH dianggap sebagai koenzim.

Regulasi aktivitas enzim Substrate-level control Feedback control Allosteric enzymes Modifikasi kovalen

Substrate level control Pada mekanisme pengendalian level substrat, jumlah produk yang tinggi dari suatu reaksi menginhibisi enzim. Contoh: Heksokinase yang berperan dalam mengkatalisis glukosa menjadi glukosa-6-fosfat, diinhibisi oleh produk tersebut. D-Glucose + ATP G6P + ADP + H+ heksokinase

Feedforward control Feedback control A  B  C  D  E

Enzim alosterik Enzim alosterik merupakan enzim multisubunit yang memiliki multi pusat aktif. Enzim ini mengikat substrat secara kooperatif (homoalosterk) dan aktivitasnya dapat diregulasi oleh molekul lain yang disebut efektor (heteroalosterik).

Homoalosterik Efek kooperativitas pengikatan substrat terhadap kinetika enzim ditunjukan dengan perbedaan antara kurva non-kooperatif dan kooperatif (sigmoid). Ciri utama dari enzim alosterik adalah adanya dua keadaan konformasi yang bergantung pada [S], yaitu keadaan T (afinitas terhadap substrat rendah) dan R (afinitas terhadap substrat tinggi). T  R T + S  TS KM tinggi R + S  RS KM rendah Pengikatan substrat oleh satu subunit R dapat menginduksi perubahan konformasi subunit lain dalam keadaan T menjadi R sehingga subunit tersebut dapat mengikat substrat (kooperatif)

Homoalosterik ekstrim Pada [S] < nilai kritis [S]c, enzim hampir tidak aktif. Aktifitasnya berubah dengan cepat ketika [S] > [S]c.

Enzim heteroalosterik Ciri utama enzim heteroalosterik adalah adanya molekul efektor yang mengontrol afinitas pengikatan substrat. Molekul efektor ada dua, yaitu: Inhibitor akan menggeser kesetimbangan T  R ke arah T. Aktivator akan menggeser kesetimbangan T  R ke arah R.

Modifikasi kovalen Beberapa enzim sama sekali tidak aktif apabila tidak dimodifikasi secara kovalen. Contoh protein-protein kinase. Sebelum mengalami fosforilasi enzim ini tidak aktif, tetapi setelah difosforilasi enzim ini menjadi aktif.

Modifikasi kovalen: Aktivasi zimogen protease pankreas

Soal Latihan Kinetika

Solusi (a) Tanpa Inhibitor: Vmax = 45, 45 mol/menit KM = 10,18 M Ada inhibitor: K’M = 30,27 M

Solusi (b) dan (c) (b) Tipe inhibisi: kompetitif (c)

Solusi (d)

Solusi (e)