Fiksasi, dehidrasi, dan clearing Eko Prasetya, M.Sc.

fiksasi

fiksasi Sebagian besar jaringan hewan maupun tumbuhan akan rusak jika dipisahkan dari indukan multiselulernya dikarenakan ketidak mampuan sel untuk mempertahankan bentuk alaminya. Maka, untuk mempertahankan bentuk alaminya, dibutuhkan suatu proses yang disebut dengan fiksasi (to fix) yang artinya menetapkan pada bentuk alamiahnya, dikeraskan dan distabilkan untuk dapat mempertahankan bentuknya selama proses pembuatan preparat.

Kerusakan jaringan pasca kematian Aktifnya enzim-enzim autolysis yang menyebabkan kerusakan jaringan dengan cara memecah protein menjadi asam amino. Asam amino kemudian keluar dari sel dan tidak dapat digunakan kembali. Hal ini menyebabkan protein structural yang terdapat pada hampir seluruh jaringan akan rusak.

Tujuan fiksasi Menghentikan proses metabolic secara cepat Mencegah terjadinya perubahan yang bersifat regresif Mengawetkan bahan histologis dan sitologis Mempertahankan bentuk actual bahan biologis Mengeraskan dan menstabilkan bahan-bahan biologis karena terjadi koagulasi protoplasma Memberi kemungkinan adanya perbedaan optic pada proses pengamatan jaringan.

Untuk dapat melakukan fungsi fiksasi, maka proses fiksasi membutuhkan reagen yang disebut dengan larutan fiksatif. Larutan fiksatif merupakan larutan yang menjalankan tugas dengan tujuan fiksasi.

Sifat larutan fiksatif Memiliki daya penetrasi yang baik ke dalam jaringan Dapat menembus jaringan dengan cepat tanpa menyebabkan kerusakan Mencegah perubahan jaringan secara cepat Memiliki kemampuan koagulasi protoplasma dengan baik Tidak merusak jaringan dan isi sel Melindungi jaringan selama proses pengerjaan preparat Membuat bagian jaringan lebih jelas

Proses fiksasi harus dilakukan sesegera mungkin setelah proses pengambilan jaringan untuk mencegah kerusakan jaringan atau sel sebelum dilakukannya fiksasi. Ingat: Fiksasi memiliki fungsi menetapkan jaringan, bukan mengembalikan jaringan ke bentuk semula sehingga kerusakan yang diakibatkan sebelum terjadinya fiksasi tidak dapat diperbaiki.

Larutan fiksatif idealnya mampu menjalankan fungsi seperti tujuan fiksasi. Namun, fiksasi ideal sangat sulit untuk ditemukan. Setiap larutan fiksatif memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-masing.

Kesulitan penggunaan larutan fiksatif Fiksatif ideal sangat sulit ditemukan karena jaringan memiliki karakter yang berbeda-beda. Dapat mengawetkan sel tertentu tetapi melarutkan bahan sel yang lainnya. Bersifat mordant pada jaringan tertentu, tetapi mengganggu proses pewarnaan pada jaringan lain. Tidak ada larutan fiksatif tunggal yang ideal, biasanya yang baik, larutan bersifat majemuk.

Mampu memfiksasi inti sel dengan baik, namun cenderung menggembungkan jaringan (asam asetat). Penetrabilitas jaringan yang buruk, daya pengerasan jaringan kurang, daya awet nucleus rendah, tetapi merupakan bahan pengawet dan mordant sitoplasma yang sangat baik (Kalium Dikromat). Formalin dan glutaraldehidal merupakan fiksatif yang umum digunakan dalam bentuk larutan tunggal.

Fiksatif yang baik Fiksatif yang baik biasanya terdiri dari larutan majemuk dengan kemampuan koagulan dan kemampuan nonkoagulan sekaligus. Contohnya larutan campuran antara asam asetat dan kalium dikromat.

Koagunan akan mengubah protein menjadi serat halus (menautkan antar protein agar tidak rusak) sehingga paraffin dapat dengan mudah diinfiltrasi sehingga jaringan menjadi lebih stabil pada saat disayat. Nonkoagulan menimbulkan sedikit artifak, tetapi jika digunakan tunggal dapat menimbulkan inkonsistensi pada jaringan sehingga mengganggun proses infiltrasi dan embedding.

Memilih larutan fiksatif Jenis dan tujuan pengamatan yang akan dilakukan Jenis sel atau jaringan yang akan difiksasi Memahami efek negative dan positif dari setiap larutan fiksatif Memahami jenis larutan fiksatif yang digunakan untuk keperluan umum dan khusus. Larutan fiksatif umum antara lain, formadelhida, glutaraldehida, etanol, asam asetat, asam pikrat, kalium dikromat, mercuri klorida, asam kromat, dan osmium tetroksida.

Keuntungan dan kerugian larutan fiksatif (studi kasus larutan bouin) Formaldehida Mampu memfiksasi sitoplasma dengan baik Menghambat penetrasi paraffin dalam jaringan; Fiksasi kromatin yang buruk Asam Pikrat Koagulasi sitoplasma yang baik dan asidofilik, memudahkan paraffin untuk penetrasi, jaringan tetap lembut dan stabil, mampu memfiksasi kromatin Mengerutkan jaringan dan membuat kromatin menjadi asidofilik Asam Asetat Mengurangi pengerutan jaringan, inti, dan sitoplasma Melarutkan sel

Larutan fiksatif umum dan tujuannya Tujuan Penggunaan Larutan Fiksatif Jenis Larutan Fiksatif Tujuan pengamatan masih belum jelas Formalin Anatomi komponen sel secara sederhana Formalin, Comori, Zenker, Helly, atau Bouin Pengamatan inklusi sel secara khusus Carnoy, Flemming, Champy, Helly, Schaudinn atau Regaud Pengamatanhistokimia Aldehida, Aseton, atau Etanol

Fiksatif tunggal Asam asetat Osmium tetroksida Aseton Asam pikrat Kromium Trioksida Kalium dikromat Alkohol Asam trikloroasetat Aldehida/Formalin Natrium sulfat Merkuri Klorida

Fiksatif majemuk Fiksatif Campuran Komponen Larutan Mueller Kalium dikromat 2,5 atau 3 gram Natrium sulfat 1 gram Aquades 100 ml Larutan Orth Kalium dikromat 2,5 gram Aquades 90 ml Formalin 10 ml Larutan zenker Merkuri klorida 5 gram Aquadest 100 ml Larutan Helly Larutan Zenker 10 ml Formalin komersial 1 ml Fiksatif Campuran Komponen Larutan Heidenhain Kalium dikromat 1,8 gram Merkuri klorida 4.5 gram Asam asetat glasial 4,5 ml Formalin komersial 10 ml Aquades 90 ml Larutan Lavdowsky Kalium dikromat 5 gram Merkuri klorida 0,15 gram Asam asetat glasial 2 ml Akuades 100 ml Larutan Mann H2O panas 100 ml Merkuri Klorida 2,5 gram Asam pikrat 1 gram

Fiksatif majemuk Fiksatif Campuran Komponen Larutan bouin Asam pikrat jenuh 75 ml Formalin komersial 20 ml Asam asetat glasial 5 ml Larutan allen B Kristal asam kromat 1,5 gram Kristal urea 2 gram Larutan Gilson Merkuri klorida 20 bagian Asam kromat 1% 20 bagian Asam nitrat 2 bagian Asam asetat glasial 2 bagian Larutan Bensey AOB Asam osmat 2% 2 ml Kalium dikromat 2,5% 8 ml Asam asetat glasial 1 tetes Fiksatif Campuran Komponen Larutan regaud Kalium dikromat 3% 80 ml Formalin komersial 20 ml Larutan Bianco Asam kromat 1 gram Asam asetat glasial 5 ml Aquadest 100 ml Larutan Gate Asam kromat 0,7 gram Asam asetat glasial 0,5 ml Larutan Navashin Asam kromat 0,8 gram Asam asetat glasial 20 ml Formalin komersial 5 ml

Fiksatif majemuk Fiksatif Campuran Komponen Larutan carnoy Alkohol Absolut 60 ml Kloroform 30 ml Asam asetat glasial 10 ml Larutan AFA (Alkohol Formalin Asetat) Etanol 70% 90 ml Formalin komersial 10 ml Asam asetat glasial 2 ml Larutan kormer Kalium dikromat 1,8 gram Uranil asetat 0,75 gram Formalin komersial 3,6 ml Asam asetat glasial 9 ml Asam trikloroasetat 4,8 ml Aquadest 87 ml Fiksatif Campuran Komponen Larutan Petrunkewitsch A Asam nitrat 12 ml Nitrat dari cuprum 8 gram Aquadest 100 ml Larutan Petrunkewitsch B Phenol 4 gram Etil eter 6 gram Etanol 80%

Pertimbangan Penggunaan larutan fiksatif Memperhatikan tujuan pengamatan dalam pembuatan preparat histologi Efek pengerasan jaringan yang ditimbulkan oleh larutan fiksatif Volume larutan fiksatif yang digunakan Waktu perendaman jaringan menggunakan larutan fiksatif

Perlakuan sebelum fiksasi Maserasi Jika jaringan terlalu padat seperti jaringan otot atau lainnya, maka perlu diberikan perlakuan sebelumnya untuk proses disosiasi selama fiksasi. Larutan maserasi bukanlah larutan fiksatif, sehingga setelah proses maserasi, larutan harus segera dimasukkan ke dalam larutan fiksasi kembali.

Fiksasi selain menggunakan perendaman Fiksasi dengan cara perfusi Memaksa larutan fiksatif masuk ke dalam jaringan menggunakan alat. Biasanya digunakan untuk pengawetan hewan yang baru mati atau hewan yang masih hidup tetapi dibawah pengaruh anestesi. Fiksasi ini untuk jaringan yang harus segera difiksasi tetapi tidak dapat diambil dengan cepat. Contoh jaringan: Sistem saraf Contoh alat: Canulla glass

Tikus dengan sel saraf pusat pada otak yang akan dikoleksi dan dibuat menjadi preparat histologi

Hewan difiksasi segera dengan cara perfusi sebelum organnya dikoleksi untuk menghindari kerusakan organ tersebut.

dehidrasi

dehidrasi Molekul air yang digunakan pada tahapan fiksasi dapat mengganggu tahapan selanjutnya dari proses pembuatan preparat (kecuali metode beku). Tahapan pembuangan air tersebut, disebut dengan tahapan dehidrasi. Untuk kebanyakan jaringan, tahapan dehidrasi diikuti dengan tahapan penjernihan (Clearing) sehingga jaringan menjadi jernih (transparan) sebelum diinfiltrasi.

Tujuan dehidrasi Menarik air dari dalam jaringan setelah difiksasi Mencuci dan memperkokoh jaringan yang keras dan rapuh

Proses dehidrasi Melewatkan jaringan melalui satu seri larutan yang dapat menarik air dengan konsentrasi larutan semakin naik dan konsentrasi air semakin menurun. Larutan akan menarik air dan kemudian menempati ruangan yang ditinggalkan oleh air tersebut.

Syarat Larutan pendehidrasi Dapat menarik air dari dalam jaringan Dapat bercampur dengan clearing agent (larutan penjernih) Tidak membatalkan fungsi fiksasi Dapat mempertahankan bentuk jaringan seperti setelah difiksasi Mampu mengisi ruangan pada jaringan yang ditinggalkan oleh air. Sebaiknya digunakan dalam keadaan segar

Larutan pendehidrasi Alkohol Merupakan larutan pendehidrasi yang umum digunakan Dapat bercampur dengan xylol (clearing agent) Dimulai dari konsentrasi terendah hingga konsentrasi tertinggi (absolut) Pada konsentrasi dibawah 70% atau 80%, tidak boleh ditahan lebih dari 30-45 menit (kontiniu) pada masing-masing konsentrasi

Larutan pendehidrasi (alcohol) Pada jaringan yang difiksasi dengan larutan Zenker dan Helly, pada konsentrasi alcohol 70%, tambahkan iodium tincture yang berfungsi untuk melarutkan merkuri klorida dari dalam jaringan. Pelepasan merkuri klorida ditandai dengan warna pada larutan pendehidrasi. Jika masih berwarna, ulangi penambahan iodium tincture hingga warna menjadi bening.

Penggunaan alcohol absolut memiliki biaya produksi yang sangat tinggi Penggunaan alcohol absolut memiliki biaya produksi yang sangat tinggi. Maka dianjurkan untuk memproduksi alcohol 95%. Untuk membuat larutan alcohol 80% dari alcohol 95%, cukup campurkan 80% bagian alcohol 95% dengan 15 bagian aquades.

Dioksan (kombinasi dehidrasi dan infiltrasi) (keuntungan) Lebih praktis dan lebih cepat dibandingkan dengan alcohol Kualitas sayatan sebanding dengan dehidrasi alcohol Dapat bercampur dengan baik menggunakan air, alcohol, dan xylol Menghemat alcohol dan xylol Dapat bercampur dengan Canada balsam Harga lebih murah dibanding dengan xilol Pengerutan jaringan tidak terlalu signifikan dan dapat melarutkan merkuri

Dioksan (kombinasi dehidrasi dan infiltrasi) (kerugian) Bersifat toksik (beracun) Sangat mudah menguap, sehingga harus disimpan dalam botol tertutup rapat Sering mengandung air dan bahan lain sehingga kemurniannya berkurang Adanya air dan bahan lain menyebabkan pengerutan jaringan hingga 50% Berwarna keruh jika sudah mengandung air.

n-butyl alcohol (Kombinasi dehidrasi dan infiltrasi) Baik digunakan untuk jaringan yang keras Sangat baik untuk membuat sayatan embrio

n-butyl alcohol (Kombinasi dehidrasi dan infiltrasi) (metode) Metode pertama Jaringan langsung dipindah ke paraffin lembut → medium → keras sebelum diembedding ke paraffin. Jaringan dibiarkan lama pada setiap paraffin agar alcohol keluar dari paraffin. Metode kedua Jaringan dipindahkan ke n-Butyl Alcohol : Parafin keras (1:1) di dalam oven. Campuran dibiarkan beberapa hari hingga alcohol menguap dari paraffin.

Clearing (penjernihan) Merupakan tahapan transisi dari alcohol ke paraffin Menghilangkan opasitas (tidak tembus cahaya) atau menjadikan jaringan bening/jernih Menggunakan larutan yang dapat bercampur dengan paraffin karena alcohol tidak dapat melarutkan paraffin Pada metode menggunakan celloidin, tidak perlu melakukan penjernihan karena celloidin larut dalam alcohol absolut dan eter.

larutan penjernih (clearing) Larutan penjernih yang umum digunakan adalah Xylol (xylene), Toluol (toluene), kloroform, dan minyak Cedar atau Metil Salisilat. Xylol merupakan larutan penjernih yang paling sering digunakan karena memiliki kecenderungan mengeraskan jaringan sehingga perlu perhatian dalam penggunaannya terutama untuk jaringan ikat, otot, dan tulang rawan.

Xylol dan toluol Mengeraskan jaringan Dapat menguap keluar dari jaringan, sehingga butuh pengerjaan yang cepat Setelah didehidrasi, jaringan dimasukkan pada campuran alcohol:xylol (1:1) selama 30 menit dan 2x xylol selama 30-60 menit Jaringan dipindahkan pada paraffin lembut yang telah dicairkan dalam oven Toluol tidak terlalu cepat menguap dan tidak mengeraskan jaringan secara berlebih.

kloroform Perendaman dengan campuran alcohol : Kloroform (1:1) hingga jaringan tenggelam ke dasar wadah. Semakin banyak menyerap kloroform, semakin berat jaringan. Bersifat mengeringkan sehingga tidak direkomendasikan.

Minyak cedar atau metil salisilat Dapat digunakan langsung dari alcohol 95%, karena bersifat mengeluarkan air Harus direndam semalam penuh untuk mengeluarkan alcohol dari jaringan dan digantikan dengan minyak cedar Minyak harus dikeluarkan terlebih dahulu sebelum infiltrasi dengan penambahan toluol

TERIMA KASIH