Rencana Perkuliahan Aliran Informasi Genetik Teknologi DNA Rekombinan PCR & Diagnosis Molekuler (Aplikasi PCR) Teknik Biologi Molekuler (UTS) Produksi Biopharmaceutical & Vaccine 1X Teknologi Fermentasi Senyawa Obat 1 X Produksi Metabolit Sekunder senyawa Obat 2 X Presentasi Kelompok Topik (Aplikasi PCR, Produksi Protein terapetik, Fermentasi senyawa obat/pangan, produksi met. Sekunder via kultur jaringan dan tanaman transgeni, prod met sekunder via combinatorial biosinthesis 3X. BIOTEKNOLOGI

Teknologi DNA Rekombinan Restriksi Endonuklease Ligasi & Ligasi DNA Vektor Kloning & Rekombinan DNA Isolasi DNA & RNA

Goal.. Pemanfaatan Manipulasi Gen dalam Pengobatan

DNA Rekombinan

Nucleases Nukleotida IK. Hidrogen Phospodiester

Exonuclease VS Endonuclease Nuclease dapat memotong/degradasi molekul DNA dengan membelah IK. Phosfodiester yang menghubungkan nukleotida Exonuclease menghilangkan nukleotida pada posisi ujung molekul DNA Endonuclease memotong ikatan dalam phosfodiester molekul DNA

Restriction Endonuclease (RE)

Enzim Restriksi

Ligasi Ligase : Enzim yang mensintesis pembentukan ikatan phosfodiester yang menghubungkan nukleotida satu dengan yang lainnya

Ligasi

Restriksi & Ligasi

DNA VEKTOR Vektor kloning berfungsi untuk memperbanyak fragmen DNA yang disisipkan, sehingga fragmen DNA hanya di replikasi, tidak di transkripsi. Vektor ekspresi digunakan untuk produksi protein.

Vektor (Biotranspor) Plasmid Virus lambda bacteriophaga Cosmid

Plasmid DNA untai ganda Berbentuk lingkaran Bersalinan tinggi (high copy number) Berukuran kecil (mudah dimanipulasi) Dapat bereplikasi sendiri Dapat disisipi DNA asing Memiliki 2 gen marker : untuk mendeteksi adanya vektor dan DNA sisipan

Tahapan kloning Isolasi/preparasi DNA sisipan dan DNA Vektor Pemotongan molekul DNA Penggabungan fragmen DNA sisipan ke DNA vektor Transformasi Identifikasi Isolasi DNA rekombinan

Transfromasi Sel kompeten : sel mampu menerima DNA asing. Sel diberi lar. CaCl 2 agar sel menjadi permeabel dan bermuatan + (DNA-). Cara Heat Shock dan Kejutan listrik.

Kemungkinan dalam transformasi? Sel kompeten tidak kemasukan DNA apapun Sel kompeten kemasukan DNA vektor tetapi tidak membawa gen X Sel kompeten kemasukan DNA vektor dan membawa gen X (DNA rekombinan)

Seleksi putih biru Jika ada tiga cawan yang diisi media padat, masing-masing diberi label media A, B dan C A hanya media padat B media yang ditambah antibiotik (mis Pinicilin) C media padat ditambah antibiotik, X-gal dan IPTG Apa yang terjadi dalam media A, B dan C

Seleksi putih biru Media A, semua sel kompeten hidup Media B, lebih sedikit sel kompeten hidup dari media A karena sel kompeten yang membawa DNA resisten antibiotik. Media C, sama dengan media B tetapi pada media tersebut ada dua warna Biru dan Putih

Seleksi putih biru

Next... Konfirmasi DNA rekombinan PCR