ANALISIS ASAM AMNIO DAN PROTEIN Abdul Rohman Fakultas Farmasi UGM

Bahan Pembelajaran Analisis asam amino dan Protein Pendahuluan Analisis Asam amino Titrimetri Gasometri Spektrofotometri Kromatografi

Asam amino AA merupakan monomer penyusun protein. Kebanyakan protein disusun oleh 20 asam amino Sumber utama diet AA pada manusia berasal dari protein, yang secara enzimatis akan didigesti untuk membebaskan AA-nya AA dapat berada dalam bentuk bebas atau terikat dalam peptida atau protein  menentukan metode analisis dan penyiapan sampelnya

What is amino acid? What is amino acid? Amino Acid: aminated carboxylic acid (R-COOH) R group

Examples -amino acetic acid -amino propanoic acid ,-2 amino caproic acid

Classification of Amino Acid 1. By the location of Amino-group ： / / -AA 2. By its acidity： neutral/ acidic/ basic AA ratio of Amino-group to carboxylic group 3. By whether containing phenyl group aromatic / non aromatic AA 4. By its occurrence in protein Protein / non protein AA 5. By polarity of R group : polar / apolar side chain AA 6. By its nutrient value to human: Essential AA and non-essential AA

20 -AA commonly found in proteins -aa structure Name glycine alanine valine leucine isoleucine

Continued -aa structure Name methionine proline phenylalanine tryptophan serine

continued -aa structure En name threonine cystine tyrosine asparagine glutamine

continued -aa structure En name Aspartic acid Glutamic acid lysine arginine histidine

Titrasi Formol

Gasometri Gugus alfa amino primer dari asam amino bereaksi dengan asam nitrit dan menghasilkan gas nitrogen (N2). Asam nitrit ini dibuat dengan mereaksikan natrium nitrit dengan asam asetat. Gas nitrogen yang terjadi dimurnikan dengan mengalirkannya pada kalium permanganat, untuk selanjutnya dikumpulkan dan diukur volumenya.

Spektrofotomeri UV Aromatic AAs absorb light in the near ultraviolet (230-300nm). phenylalanine tyrosine Note: This UV absorption property of protein is solely determined by the content of these 3 aromatic AAs. However, far ultraviolet (190nm)absorption of protein stems from the peptide bond. tryptophan

UV Spectra

Derivative spectrophotometry

Spektroskopi visibel Ninhidrin Metode yang dikembangkan

Ninhidryn FRIEDMAN, M. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 385−406

Contoh Metode yang dikembangkan

High performnce liquid Chromatography

Detektor Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling umum digunakan untuk analisis bahan makanan menggunakan KCKT. AA dapat dideteksi secara langsung dengan UV karena AA mampu menyerap di panjang gelombang antara 190 – 210. Meskipun demikian, karena kebanyakan pelarut dan juga komponen matriks sampel yang lain juga menyerap di daerah ini, maka AA harus diderivatisasi terlebih dahulu sebelum dianalisis dengan KCKT menggunakan detektor spektrofotometer UV-Vis. Derivatisasi AA dapat dilakukan sebelum pemisahan di kolom kromatografi (pre-column derivatization) atau dilakukan setelah AA keluar dari kolom (post-column derivatization).

Beberapa agen penderivat yang digunakan Dideteksi di panjang gelombang 570 nm

Dansil klorida Dansil-AA dideteksi dengan fluoresensi (λeks 360 nm; λemisi = 470 nm) dan dengan UV (λmaks 250 nm) Source: Snyder et al., 1997

Dabsil klorida Turunan dabsil menunjukkan serapan maksimal di 420 nm (daerah tampak), serta sangat stabil, dan batas deteksinya berada di level pmol. Turunan ini tetap stabil setelah penyimpanan selama 4 minggu di suhu ruang.

1-fluoro-2,4-dinitrobenzena (FDNB)

Fenilisotiosianat Karena hasil derivatisasi bersifat tidak berfluoresensi, maka teknik derivatisasi dengan PITC dideteksi dengan spektrofotometri UV-Vis, yang umumnya dilakukan di 254 nm (λmaks = 269 nm). Meskipun derivatisasi ini tidak sepeka dibandingkan dengan teknik derivatisasi yang menghasilkan derivat yang dideteksi dengan fluoresen, akan tetapi produk PTC-AA bersifat sangat menyerap UV, sehingga AA dengan level pmol dapat dideteksi. Batas sensitifitas agen penderivat ini adalah 50 pmol pada rasio sinyal/derau (S/N) 2,5

orto-ftalaldehid Derivat yang dihasilkan antara AA dengan OPA dapat dideteksi dengan UV pada panjang gelombang 330 nm, akan tetapi untuk menghasilkan sensitifitas yang tinggi, maka digunakan detektor fluoresen dengan λeks = 330 nm dan λ em = 430 nm.

Dietil 2(etoksimetiliden)propandioat Deteksi UV: 280 nm

Kromatogram standar AA (atas) dan AA dalam sampel madu (bawah) Kromatogram standar AA (atas) dan AA dalam sampel madu (bawah). Deteksi UV = 280 nm). Konsentrasi standar AA (mg/kg) di berikan dalam tanda kurung.1 = histidin (6,4); 2 = arginin (15,4); 3= asparagin (20,8); 4 = glutamin (41,8); 5 = serin (9,9); 6 = asam aspartat (25,3); 7 = asam glutamat (12,7); 8 = treonin (8,0); 9 = glisin (5,1); 10 = β-alanin (3,5); 11 = asam γ-aminobutirat (2,4); 12 = α-alanin (7,0); 13 = prolin (948,3); 14 = tirosin (15,7); 15 = metionin (3,5); 16 = valin (4,7); 17 = cistein (15,1); 18 = triptofan (7,2); 19 = ornitin (2,11); 20 = fenilalanin (93,2); 21 = isoleusin (14,5); 22 = leusin (15,5); 23 = lisin (7,8) Source: Rebane, R. and Herodes, K. 2010. Analytica Chimica Acta 672: 79–84

Gas Chromatography Principle: Non-volatile AA Volatile AA-derivate

Automatic AA analyzer From pH2.2 to pH 6.4