TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Kelompok 1 Saidatun Ni’mah (A1C208048) Nurbidayah (A1C208045) Devy Dwi Rahayu (A1C208070) Zubaidah (A1C208073) Sugiannor (A1C208039) Hamdan (A1C208044) Risa Aulia (A1C208029) Mella Mutika Sari (A1C208031) Rina Ocktaviana (A1C208013) M. Sidiq Oktaviandi (A1C208001)

Pengertian Teknologi DNA Rekombinan pembentukan kombinasi materi genetik yang baru Dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional

Teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu, yaitu isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang analisis DNA rekombinana

Isolasi DNA Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel Langkah selanjutnya adalah lisis sel Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

Enzim Restriksi Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa

Ligasi Molekul – molekul DNA Ada tiga cara, yaitu: ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’

Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan Dikarenakan DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu:

(2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni.

Pembuktian Gen sebagai bahan reaksi Diagnostik dan Sidik Jari Molekular Bahan reaksi diagnostik : Bahan reaksi biokimia untuk menguji kadar logam enzim spesifik. Antibodi untuk mendeteksi protein yang spesifik oleh ilmu pengetahuan tentang teknik tersebut seperti immunofluorescence, immunoassay radio (RIA) dan enzim menghubungkan immunosorbent uji kadar logam (ELISA).

PELABELAN DNA ASAM NUKLEAT IN VITRO Pelabelan Asam nukleat IN VITRO. Yang merupakan satu ilmu pengetahuan tentang teknik yang dikenal sebagai nick translation Mempergunakan metode acak primer. Suatu campuran dengan urutan acak hexanukleotida ditambahkan ke DNA. Beberapa hexanukleotida itu akan dihibridisasi ke DNA dan berperan sebagai inisiasi untuk DNA Polimerase

Synthesis of labeled DNA by nick translation

PENGGUNAAN GEN PEMERIKSA MELAWAN PENDETEKSIAN IMUNOLOGI Penggunaan pemeriksaan gen tidak terbatas kepada pendeteksian viroids; dengan sedikit modifikasi mereka dapat juga digunakan untuk mendeteksi bakteri. Dalam hal ini, contohnya diberlakukan bagi suatu nitrocellulose saringan sama dengan sebelumnya.

Kerugian Menggunakan Gen Pemeriksa penggunaan label radioaktif, walaupun bukan metoda pemberian label yang aktif, asam nukleat sedangdikembangkan dan ini diuraikan dalam bagian yang berikutnya. keseluruhan waktu test, yang mana pada umumnya 24- 72 jam

Pada sisi positif , teknologi pemeriksaan mempunyai dua keuntungan dibanding metoda pendeteksian imunologi : Metoda dapat diterapkan tanpa modifikasi sebagai contoh darah, tinja, badan atau nanah exudates yangmana terlalu kotor untuk mengijinkan zat darah menyerang kuman dengan interaksi antigen Teknologi pemeriksaan dapat mendeteksi pathogenicas faktor penentu yangmana tidak dapat diungkapkan secara imunologi; sebagai contoh, banyak dari kasus diare dan muntah-muntah yang terjadi pada orang yang bepergian keluar negeri, yang disebut' perut pelancong', muntah-muntah disebabkan oleh tegangan Escherichia coli yang mengeluarkan suatu enterotoxin

PEMERIKSAAN UNTUK LABEL NON-RADIOAKTIF Walaupun pemeriksa berlabel dengan fosfor radioaktif memudahkan untuk pekerja riset, tetapi tidak pantas untuk suatu laboratorium diagnostik jika pengendalian mutu adalah penting untuk standardisasi test. Dengan penggunaan secara radioaktif berlabel thionucleotides mengakibatkan pemeriksaan dapat diperluas. Suatu solusi alternatif dengan menggunakan biotin- berlabel nucleoside triphosphates selama nick translation

BLOTTING SOUTHERN Potensi DNA yang diagnostik- DNA hybridisasi sangat dapat ditingkatkan dengan bantuan Blotting Southern. Teknik ini dinamai Ed Southern yang dikembangkan pada tahun 1975

DNA dicerna dengan suatu pembatasan endonuclease dan fragmen yang mana diproduksi dengan cara dipisahkan pada suatu basis ukuran oleh electrophoresis dalam suatu agarose 'gel' agar-agar. DNA fragmen kemudian mengubah sifat ke dalam rantai tunggal oleh endapan 'gel' agar-agar dalam alkali. Sesudah itu, 'gel' agar-agar ditempatkan pada suatu kertas saringan yang menutupi sampai terbenam dalam suatu palung penyangga/bantalan. Suatu lembar selaput nitrocellulose ditempatkan di paling atas sehingga 'gel' agar-agar dan suatu tumpukan kertas penyerap besar ( yang pada umumnya menutupinya dengan kertas handuk) tersangkut di atas sekali. Larutan disiapkan oleh penyerap yang ditutupi dengan kertas, melalui 'gel' agar-agar dan nitrocellulose dan membawa DNA ke luar dari 'gel' agar-agar ke atas selaput itu. Sama dengan sebelumnya, DNA diperbaiki pada tempatnya dengan mengeringkan saringan dalam suatu ruang hampa. Hasil saringan adalah suatu tiruan pada DNA fragmen mempola dari agarose 'gel' agar-agar.

Manfaat Teknologi DNA Rekombinan Meliputi empat bidang: Bidang kesehatan Bidang Pertanian Bidang Hukum Bidang Pengemangan Ilmu Pengetahuan