Teknologi DNA Rekombinan Kapas biasa Kapas-Bt 1

Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman transgenik 2 Tomat biasa Tidak tahan hama Tomat-Bt Tahan hama ► Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt tahan terhadap serangan hama karena menghasilkan toksin yang dapat membunuh hamanya. ► Toksin pada kapas-Bt dan tomat-Bt disandikan oleh gen yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt = Bacillus thuringiensis) Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman transgenik 2

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yang berasal dari jenis organisme lainnya. Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa Genetika Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA Rekombinan : kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan. (Proses: rekombinasi; Hasil: rekombinan) Teknologi DNA Rekombinan meliputi: - Teknik untuk mengisolasi DNA. - Teknik untuk memotong DNA. - Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA. - Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan. 3

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yang ada pada bakteri: 4

Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan: bakteri mempunyai mekanisme seksual: - menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. - merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat). Lihat konjugasi ! DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui 3 cara: 1. Konjugasi 2. Transformasi 3. Transduksi 5

lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel. 1. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel. DNA sel resipien Sel resipien (sel betina) DNA sel donor Pili seks Sel donor (sel jantan) 2. Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. Kromosom bakteri (DNA bakteri) DNA asing 6

3. Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage. DNA fage Kromosom bakteri DNA yang masuk ke dalam sel bakteri： a. dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. DNA asing Kromosom bakteri rekombinan Sel Bakteri b. tidak dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri By Aris Tj 7

Perangkat utama yang digunakan pada pembentukan DNA rekombinan: •plasmid •enzim restriksi •DNA ligase •bakteri Plasmid: Terdapat pada bakteri DNA selain kromosom Berbentuk sirkuler Umumnya berukuran kecil (lebih kecil dari ukuran kromosom bakteri) Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri 8

Enzim Restriksi untuk memotong DNA: Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A pada sekuens GAATTC. 9

Setiap enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenal sekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA pada situs pemotongan yang khas. Nama Enzim Sekuens Pengenal Organisme asal EcoRI G↓AATTC Escherichia coli HindIII A↓AGCTT Haemophilus influenzae HhaI GCG↓C Haemophilus haemolyticus TaqI T↓CGA Thermus aquaticus BsuRI GG↓CC Bacillus subtilis BalI TGG↓CCA Brevibacterium albidum NotI GC↓GGCCGC Nocardia otidiscaviarum BamHI G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciens SmaI CCC↓GGG Serratia marcescens 9

Enzim DNA ligase untuk menyambung DNA 10

Menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase: Jackson, Simon & Berg (1972) berhasil membuat DNA rekombinan. 12

mengekspresikan informasi genetik dengan menggunakan Bagaimana menyisipkan, memperbanyak dan mengekspresikan informasi genetik dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan? Bakteri Sel berisi gen yang diinginkan gen Penyisipan gen Plasmid Gen yang diinginkan Memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri Bakteri rekombinan Copy gen Perbanyakan sel bakteri Copy protein Klon bakteri rekombinan Protein untuk membuat salju Gen di- sisipkan pada tanaman Gen untuk mengubah bakteri agar dapat membersihkan limbah Protein untuk melarutkan gumpalan darah dalam terapi serangan jantung 13

Fungsi Plasmid pada pembentukan DNA rekombinan: a. digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. b. untuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri

Bagaimana menyimpan seluruh informasi genetik dari suatu organisme?? Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. Isolasi gen menggunakan pendekatan “shotgun” dapat menghasilkan ribuan potongan DNA (fragmen DNA) Potongan disimpan untuk sementara waktu di dalam pustaka plasmid atau pustaka fage 15

untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Bagaimana mendeteksi DNA atau fragmen DNA? Teknik Elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Campuran molekul DNA dengan berbagai ukuran Ｍｏｌｅｋｕｌ berukur besar Sumber listrik Gel Ｍｏｌｅｋｕｌ berukur kecil (+) Fragmen DNA yang lebih besar bergerak lebih lambat, fragmen yang lebih kecil bergerak lebih cepat. 16

Bagaimana membuat dan menyisipkan DNA rekombinan pada tanaman: Bakteri Agrobacterium tumefaciens untuk menyisipkan gen ke dalam genom tanaman. Prinsip: Agrobacterium tumefaciens strain liar (galur alami) memiliki plasmid Ti. Pada plasmid Ti terdapat T-DNA yang mengandung gen penyebab tumor. Pada waktu menginfeksi tanaman, Agrobacterium tumefaciens menyisipkan T-DNA ke dalam kromosom sel tanaman sehingga sel-sel tanaman yang terinfeksi membentuk tumor. T-DNA Plasmid Ti T-DNA Kromosom bakteri Agrobacterium Kromoso m tanaman 17

Gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam sel tanaman dengan cara menitipkannya (menyisipkan) pada T-DNA. Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi sel tanaman adalah Agrobacterium yang sudah tidak patogen Agrobacterium DNA mengandung gen yang diinginkan Plasmid-Ti Penyisipan gen Introduksi ke dalam sel tumbuhan Regenerasi tanaman Plasmid-Ti rekombinan T-DNA Situs restriksi T-DNA membawa gen baru pada kromosom tumbuhan Tanaman dengan sifat baru 18

Manfaat Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang ilmu pengetahuan maupun di bidang terapan. Contoh: A. Bidang Kesehatan: A1. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. Merek dagang: HumulinR A2. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri A3. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol). 19

A4. Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit-penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker) Klon gen (alel normal) Penyisipan normal gen pada vektor DNA rekombinan Vektor retrovirus Infeksi sel bone marrow DNA rekombinan menyisip ke kromosom Sel bone marrow dari pasien Sel Bone marrow mengandung stem sel yang mampu miningkatkan semua sel-sel darah dan Injeksi sel sistem imun ke pasien 20

B1. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah B. Bidang Pertanian: B1. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu rendah. Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar tanaman tidak membeku di musim dingin. Telah diperdagangkan dengan merek FrostbanR. B2. mikroba pendegradasi limbah. B3. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt B4. Tanaman tahan herbisida. 21

B 5. Peningkatan nilai nutrisi Tanaman Rice Tomato Sugar beet Penambahan nutrisi Provitamin Flavonoid Fructants Iron Keuntungan Vitamin A supplement Antioxidant Low calori Iron 22

Bioteknologi Kelautan • Penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkan ukuran ikan 23

Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis C. Bidang Hukum: Penanda (marker) Penanda (marker vagina korban Tersangka 1 Tersangka 2 Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari DNA misalnya: kasus perkosaan •pola pita DNA pada darah pelaku ke 2 sama dengan pola pita yang diperoleh dari tempat kejadian- orang ke 2 adalah pelaku kajahatannya 24

Bagaimana mencari siapa ibu kita? Hubungan keluarga berdasarkan DNA Fingerprint Bagaimana mencari siapa ibu kita? -DNA mitokondria diwariskan melalui ibu

Perbedaan pada urutan DNA dapat diketahui dengan teknik RFLP (restriction fragment length polymorfism) - untuk menentukan keturunan, -perbedaan antar satu organisme dengan yang lain. Ｍｏｌｅｋｕｌ berukuran besar Pemotongan dengan enzim restriksi Ｍｏｌｅｋｕｌ berukuran kecil DNA yang berasal dari kromosom

D. Bidang pengembangan ilmu pengetahuan: D1. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia (penyakit genetik) misalnya kanker payudara, Huntington’s disease. Huntington’s disease disebabkan oleh gen dominan • Gejala sakit mulai terlihat setelah usia pertengahan • Gejalanya antara lain: kemunduran mental, gerakan tubuh tak terkontrol, kesulitan bicara. Biasanya meninggal 10 – 20 tahun setelah timbul gejala. D2. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan (konsorsium ilmuwan internasional) untuk mewujudkan proyek genom manusia dan genom organisme lainnya 25

Teknologi DNA Rekombinan juga mengandung resiko. Penyebaran pollen berpotensi menyebarkan gen yang diintroduksi dalam tanaman transgenik ke dalam tumbuhan lainnya 22