TEKNIK ASEPTIK (STERILISASI) Sterilisasi  salah satu prosedur yg digunakan utk menghilangkan mikroorganisme/ usaha utk membebaskan lingkungan dari kontaminasi mikroorganisme Kondisi steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur, media kultur, peralatan tanam, dan eksplan 1

Kontaminasi dapat berasal dari : Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari : 1. Eksplan 2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang paling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut. 3. Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril. 4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara). 5. Kecerobohan dalam pelaksanaan.

 Berdasarkan perbedaan benda yang disterilkan, sterilisasi dapat dikelompokkan dalam tiga kategori, yakni : 1. Sterilisasi lingkungan kerja. 2. Sterilisasi alat-alat dan media. 3. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan).  Macam bentuk sterilisasi dibedakan: a. Sterilisasi dengan pemanasan (kering dan basah) b. Sterilisasi dengan ultrafiltrasi c. Sterilisasi dengan bahan kimia

 Sterilisasi dgn pemanasan basah: - Menggunakan uap panas  autoclave - Hampir semua mikroba mati pada suhu 121 0C - Waktu tergantung volume  Sterilisasi dgn pemanasan kering: - Menggunakan oven - alat yang tidak mudah terbakar (bahan gelas)  lama pemanasan 45 menit, suhu 160 0C)  Sterilisasi memakai nyala: - Alat dicelupkan dalam alkohol kmd di bakar - Digunakan selama kegiatan inokulasi, penanaman eksplan, dll 4

 Sterilisasi dengan bahan kimia: - Dipakai untuk mensterilkan permukaan saja misal: material tanaman, instrumen, tangan pekerja, ruang atau LAF - Bahan kimia yang sering digunakan: alkohol kalsium hypochlorida, natrium hypochlorida, sublimat dan chlorox  Sterilisasi memakai cahaya: - digunakan pada ruang dan kotak transfer (LAF) - Menggunakan sinar ultra violet 5

Sterilisasi Lingkungan Kerja  Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, sering kali dilakukan dalam kotak pindah steril atau dikenal dengan Laminar Air Flow cabinet.  Laminar Air Flow (LAF) yang digunakan untuk keperluan kultur jaringan harus tetap terjaga kebersihannya dan mempunyai blower dengan arah hembusan udara dari belakang ke depan atau horizontal airflow model.

 Kotak pindah ini sudah disempurnakan dengan adanya aliran udara halus yang dihembuskan dari blower kira-kira 100 hembusan per menit, melalui suatu filter yang sangat halus sehingga mikrobia dapat tersaring oleh adanya filter tersebut.  Dengan demikian udara yang mengalir atau hembusan udara tersebut adalah udara steril yang dapat mencegah kontaminan yang berasal dari airborne selama kegiatan penanaman 7

 Kotak pindah dengan aliran udara melalui suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori < 0.3 um.  Dulu, kotak pindah ini tertutup bidang mukanya selama masa pelaksanaan dengan pembukaan seminimum mungkin, hanya tempat memasukkan tangan, kotak pindah semacam ini disebut entkas.

Entkas ini dapat dibuat dari kaca semua atau kayu dan bagian mukanya saja yang terbuat dari kaca. Di dalam kotak ini terdapat lampu germisida yang memancarkan radiasi ultraviolet utk mensterilkan permukaan tempat kerja dalam kotak pindah ini. Disamping lampu ultra violet, kotak ini dapat juga disterilkan dengan penyemprotan alkohol 70% atau larutan formalin.

Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam alkohol 70%, dalam larutan kaporit, formalin atau dapat juga disemprot menggunakan spiritus (untuk menghemat biaya). Ada juga tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum kerja, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara ½-1 jam untuk mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja.

Sterilisasi Media & Alat Alat-alat gelas, peralatan dari logam atau bahan-bahan lain yg tidak mudah rusak oleh temperatur tinggi  umumnya sterilisasi dengan pemanasan kering, atau dpt dgn pemanasan basah Dissecting set & glass ware  autoclave 121 0C sekitar 20 – 30 menit, kmd simpan dlm oven pada suhu 106 0C selama beberapa menit Dissecting set  dicelupkan dalam alkohol 96% lalu dibakar dulu sebelum digunakan 11

AUTOCLAVE  Pada prinsipnya, sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap air. Temperature sterilisasi biasanya 121o C, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm.  Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. 12

Macam-macam Autoclave

Waktu yg diperlukan (121 0C)  Sterilisasi media tidak boleh terlalu lama krn dapat menyebabkan: a. Penguraian gula. b. Degradasi vitamin dan asam-asam amino. c. Inaktivasi sitokinin zeatin riboside. d. Perubahan pH yg berakibat depolimerisasi agar.  Anjuran minimal waktu utk sterilisasi media Volume Media (ml) Waktu yg diperlukan (121 0C) 20 – 50 15 menit 75 20 menit 250 – 500 25 menit 1000 30 menit 1500 35 menit 2000 40 menit 14

Sterilisasi Media Menggunakan Autoklaf Portable (Pemanasan menggunakan api) Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam. Susun botol- botol tersebut hingga mencapai permukaan panel. 15

Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar . Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat) Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap.

Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave. Tutup katup pengeluaran uap. Amati kenaikan temperature dan tekanan. Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan.

Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.

Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media.

Sterilisasi Peralatan Kultur Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan Al-foil). Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian. 2. Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang skalpel, kertas saring, petri-dish, botol-botol kosong, jarum dan pipet.

3. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif. 4. Petri-dish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang.

5. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121o C pada tekanan 15 psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan tercapai Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

Sterilisasi menggunakan oven Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah, biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160o C. Setelah disterilkan dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan alumunium foil.

Sterilisasi Bahan Tanam/ Eksplan Kultur jaringan/kultur in vitro meliputi:  penanaman sel/ agregat sel, jaringan, dan organ tanaman di media. Media tumbuh  sangat menguntungkan bagi pertumb. cendawan dan bakteri  sehingga dalam inisiasi suatu kultur harus diusahakan kultur yang aksenik (kultur hanya terdiri dari satu macam organisme yang diinginkan  dalam hal ini jaringan tanaman)

 Penyebab terjadinya kontaminasi: a. Sterilisasi media yang kurang sempurna b. Lingkungan kerja dan pelaksanaan c. Eksplan & serangga atau hewan kecil yg masuk dlm botol kultur setelah diletakkan di ruang kultur. Kontaminan yang paling sulit diatasi  yang berasal dari eksplan. Cara sterilisasi untuk masing-masing eksplan sangat spesifik

 Faktor-Faktor yang mempengaruhi tingkat kontaminan permukaan bahan tanam: Jenis tanamannya. Bagian tanaman yang dipergunakan. Morfologi permukaan (misal: berbulu atau tidak). Lingkungan tumbuhnya (green house/lapangan) Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau). Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa). Kondisi tanamannya (sakit atau dalam keadaan sehat).

 Sulit untuk menentukan metode sterilisasi standar untuk suatu jenis tanaman di tempat yang berbeda  perlu percobaan pendahuluan Di negara-negara tropis, kontaminasi permukaan ini biasanya merupakan hal yang cukup serius  sehingga beberapa tahap sterilisasi harus dilakukan.

Teknik Sterilisasi Eksplan Beberapa bahan utk sterilisasi permukaan eksplan: No Bahan Konsentrasi Lama Perendaman 1 Kalsium hipoklorid 1 – 10 % 5 – 30 menit 2 Natrium hipklorid 1 – 2 % 7 – 15 menit 3 Hidrogen peroksida 3 – 10 % 5 – 15 menit 4 Gas klorin - 1 – 4 jam 5 Perak nitrat 1 % 5,30 menit 6 Merkuri klorid 0,1 – 0,2 % 10 – 20 menit 7 Betadine 2,5 – 10 % 5 – 10 menit 8 Benlate 2 gram/lt 20 – 30 menit 9 Antibiotik 50 mg/lt 0,5 – 1 jam 10 Alkohol 70 % 0,5 – 1 menit

Bahan-bahan sterilisasi, pada umumnya bersifat toxic terhadap jaringan tanaman  perlu pembilasan berkali-kali sesudah perendaman didalam larutan sterilisasi untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang menempel di permukaan bahan tanaman. Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi misalnya: perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam natrium hipoklorid dan dibilas. Dapat juga perendaman dimulai dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru merkuri klorid, dan dibilas dengan air steril.

Pelaksanaan Sterilisasi Eksplan 1) Persiapan Sterilisasi Bahan dan peralatan yang digunakan utk sterilisasi: deterjen, bahan pemutih (clorox atau bayclin), antiseptic, air steril, fungisida dan bakterisida (benlate, dithane M-45, agrimycin/agrept): 2g/liter, larutan HgCl2: 0,5 – 1 liter), cawan petri, alat tanam yang sudah disterilkan.

2) Persiapan Bahan Tanam a. Bagian-bagian tanaman (pucuk, bagian-bagian bunga, umbi, akar/ eksplan) dicuci bersih di bawah air mengalir dan bagian-bagian yang tidak diperlukan (misal daun-daun tua atau robek, pelepah) dibuang. b. Bagian tanaman yang telah bersih direndam di dalam larutan fungisida yang telah diberi deterjen selama 30-60 menit (tergantung jenis eksplan)

c. Eksplan dibilas dengan air bersih dan dipotong menjadi bagian yang lebih kecil. Untuk bahan yang licin, berlilin atau berbulu dibersihkan dengan cara diberi bahan setipe sabun dan bersifat mengurangi tegangan permukaan d. Setelah itu, bahan tanaman direndam dalam larutan anti biotic 50 – 100 mg/liter selama 1 jam dan pekerjaan selanjutnya dilakukan di dalam laminar air flow atau enkast

Alternatif 1 3) Sterilisasi a. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam cawan petri steril, kmd dituangkan Clorox 20% sampai bahan tanam terendam & didiamkan beberapa menit (tergantung bagian tanaman yg diambil sbg eksplan) b. Eksplan dibilas dalam air steril di cawan petri kedua selama ± 5 menit, kmd bahan tanaman dimasukkan Clorox 10% selama ± 10 menit (tergantung eksplan), kmd bilas dgn air steril selama ± 5 menit.

c. Setelah itu, bahan tanaman direndam dalam larutan betadine 0,25% selama 3-5 menit dan dibilas dua kali dalam air steril. Masing-masing pembilasan ± 5 menit agar sisa-sisa betadine pada eksplan dapat larut Eksplan siap ditanam dalam media dengan menggunakan alat-alat yang telah steril.

Alternatif 2 a. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam Clorox selama 7 menit (tergantung bagian tanaman yang diambil sebagai eksplan), kemudian bilas dengan air steril selama 5 menit b. Bahan tanaman direndam dalam HgCl2 (0,5 g/liter) antara 3 – 10 menit (tergantung bahan tanaman: bagian tanaman agak keras membutuhkan waktu perendaman lebih lama ), kmd dibilas tiga kali dgn air steril, masing-masing selama 5 menit  eksplan siap ditanam dalam media dgn alat-alat yang steril

Modifikasi dalam pelaksanaan sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan: Fungisida/antibiotik – merkuri klorid – bilas dengan aquadest steril Alkohol – sodium hipoklorid – merkuri klorid – aquadest steril. Alkohol – sodium hipoklorid – betadine – aquadest steril. dan sebagainya, tergantung dari bahan yang digunakan.

Sterilisasi pada daun africa violet ( Saintpaulia ionantha), sterilisasi dimulai dengan mencelupkan daun pada alkohol 70%, dipindah ke larutan bleach 0,5%, dipindah ke larutan bleach 1 %, dipindah ke alkohol 70%, selanjutnya di bilas menggunakan aquades steril 4 kali (sumber: JA Negrón, UIPR Barranquitas, 2006)

SISTEM KULTUR JARINGAN Berdasarkan macam media tanam, sistem kultur jaringan dibedakan mjd: Metode Padat (Solid Method)  dilakukan dgn tujuan mendapatkan kalus dan kmd dgn medium diferensiasi yg berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas shg kalus dapat membentuk planlet. Media Padat  media yang mengandung semua komponen kimia yang dibutuhkan tan. & kmd dipadatkan dgn menambahkan zat pemadat (misalnya: agar-agar)

Metode padat dapat digunakan untuk: Media yang terlalu padat  mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit menembus ke dalam media Media yang terlalu lembek  menyebabkan kegagalan dlm pekerjaan (misal: karena eksplan tenggelam dalam media  eksplan tdk dapat tumbuh menjadi kalus karena tempat area kalus pada irisan (jaringan yg luka) tertutup media Metode padat dapat digunakan untuk: Kloning Menumbuhkan protoplas setelah diisolasi Menumbuhkan planlet dari protokormus stlh dipindahkan dari suspensi sel Menumbuhkan planlet dari protoplas yg sudah didifusikan (digabungkan)

b. Metode Cair (Liquid Method)  dianggap kurang praktis karena untuk menumbuhkan kalus langsung dr eksplan sangat sulit shg keberhasilannya sangat kecil. Penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel  yaitu menumbuhkan plb (protocorm like bodies). Plb dapat tumbuh menjadi planlet jika dipindahkan ke dalam media padat yang sesuai. Media Cair  pembuatannya lebih cepat dan tidak memerlukan zat pemadat sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrien Suspensi sel  mrpkan hasil kultur kalus, dmana kalus didefinisikan utk kumpulan sel yg blm berdiferensiasi, jika dipisahkan dlam kultur cair disebut kultur suspensi

- eksplan berada di permukaan media sehingga tdk c. Metode Semi Padat (Semi Solid)  biasanya untuk mikropropagasi  menumbuhkan bagian tanman dalam media aseptis dan kemudian bagian tanaman tersebut diperbanyak sehingga dihasilkan tanaman sempurna dalam jumlah banyak Media semi padat  digunakan dgn beberapa alasan: - eksplan yg kecil mudah terlihat dalam media padat - eksplan berada di permukaan media sehingga tdk memerlukan teknik aerasi tambahan pada kultur - Orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap - kalus tidak pecah jika ditempatkan di media cair