Praktikum Mikrobiologi Makanan Program Studi Gizi Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada

Acara Peralatan Laboratorium dan sterilisasi Metoda Aseptis dan Teknik Isolasi Media dan Cara Pembuatannya Teknik Enumerasi Mikrobia Uji Coliform dengan Metode MPN Pengecatan Gram Morfologi Jamur

Tata Tertib Praktikum dimulai jam 13.30 Penjelasan acara praktikum 13.30 – 14.00 Pelaksanaan Praktikum 14.00 – 16.00 Penulisan laporan sementara 16.00 – 16.30

Penilaian Pre-test / quiz Praktikum Laporan Responsi

Isi Laporan akhir (ditulis di buku yang disediakan) Judul/Acara Pendahuluan/Latar Belakang Tujuan Praktikum Cara Kerja Hasil/Pengamatan Pembahasan Kesimpulan Daftar Pustaka

Judul utama+ tujuan utama Hari tanggal, sub judul (acara yang dilakukan hari itu) Alat bahan cara kerja, Hasil dan pembahasan Kesimpulan pustaka

Pengenalan alat 8 lembar Metode aseptis 6 lbr Media dan pembuatannya 6 lbr Coliform + pengecatan 12 lbr TPC 8 lbr Jamur 10 lbr

Pengenalan alat-alat laboratorium mikrobiologi 1. Peralatan sterilisasi  a. Sterilisasi kering : alat gelas, cawan Petri, pipet. Alat yang digunakan berupa oven yang suhunya dapat mencapai 180 oC. b. Sterilisasi basah : untuk sterilisasi media, larutan, kapas, lap, dsb. Peralatan yang umum digunakan adalah autoklaf.   c. Sterilisasi saring. untuk sterilisasi cairan yang rusak bila kena panas (misal larutan vitamin)  2. Alat menghitung koloni Quebec Colony Counter 3. Laminar flow (untuk memindahkan mikrobia secara aseptis) 4. Spektrofotometer : untuk mengukur kekeruhan yaitu dengan cara mengukur sinar yang lewat pada media cair  mengukur konsentrasi mikrobia pada media cair.  5. Mikroskop

Ketrampilan dasar Persiapan/pembuatan media Sterilisasi dan penanganan/pembuangan limbah Metoda aseptik (aseptic transfer – untuk memindahkan kultur) Penyimpanan mikrobia Kultur dalam agar miring Deep freeze (dg cryoprotectant) Liofilisasi (dalam ampul)

Sterilisasi Sterilisasi – basah, kering, filtrasi Sterilisasi basah / uap panas kombinasi suhu, tekanan dan waktu (121C, 15 mnt, 15 lbs/square inch) Sterilisasi kering untuk alat-alat gelas Sterilisasi dengan uap panas dilakukan pada media yang akan digunakan baik sebelum dan sesudah inokulasi dengan mikrobia

Metode aseptis dan teknik isolasi Kultur murni: apabila kultur ini hanya terdiri dari satu spesies mikrobia saja. Jika spesies mikrobia yang lain secara tidak sengaja masuk ke dalam kultur murni, kultur tersebut dikatakan telah terkontaminasi, dan tidak lagi dikatakan sebagai kultur murni tetapi kultur campuran.

Isolasi dengan cara goresan Hasil goresan yang baik Cawan - terkontaminasi Goresan yang berasal dari dua jenis bakteri Cara goresan yang salah Koloni kurang terpisah

Koloni bakteri : Morfologi (bentuk dan struktur) Bentuk dan ukuran koloni : irreguler Margin/edge : undulate/wavy Elevataion : umbonate Warna : putih Tekstur : dry (rough)

Setelah diperoleh kultur yang murni, yang harus diperhatikan adalah : 1. seluruh material yang akan berhubungan langsung dengan mikrobia harus steril, 2. seluruh media yang digunakan untuk menumbuhkan sel juga harus steril 3.  tidak ada kontaminan yang masuk dan tumbuh. Metode yang digunakan untuk memelihara kultur murni atau bekerja dengan kultur murni ini disebut metode aseptis.

Pembuatan Media media kompleks dan media sintesis (defined media). Komponen penyusun media pertumbuhan : air, sumber karbon, sumber energi, mineral, faktor pertumbuhan, maupun konsentrasi ion hidrogen (pH). Dari segi nutriennya, media pertumbuhan dibedakan menjadi dua yaitu : media kompleks dan media sintesis (defined media). Media kompleks kaya akan nutrien (macam nutriennya banyak dan konsentrasinya tinggi), akan tetapi macam dan konsentrasi nutriennya tidak diketahui. Media sintesis terbuat dari bahan kimia murni dengan konsentrasi yang terukur dan dilarutkan dalam air murni.

Media dan cara penyiapannya (1)

Media dan cara penyiapannya (2) Media harus disimpan dengan kondisi tertutup rapat dan pada kondisi (suhu) yang sesuai Perhatikan masa kadaluwarsa media Sendok yang digunakan untuk menimbang harus kering dan bersih, hindari tercampurnya bahan-bahan penyusun media

Media dan cara penyiapannya (3) Tuang media pada suhu yang tidak terlalu tinggi (50C) Hindari kondensasi yang terjadi pada cawan bagian dalam - kondensasi akan mempengaruhi koloni yang tumbuh Cermati media dengan seksama sebelum dipakai – adakah kontaminasi ? Agar miring untuk jamur (mold) jangan terlalu dekat dg tutup

Enumerasi Mikrobia dengan menghitung koloni Cara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia hidup. Mikrobia dikatakan hidup bila dari satu sel mikrobia mampu membentuk koloni pada media padat. Dari jumlah koloni tiap cawan petri dapat ditentukan jumlah mikrobia tiap ml atau gram bahan setelah dikalikan dengan faktor pengencerannya

Ada beberapa variasi pada enumerasi dengan cara ini, yaitu : 1.Pour plates 2.Spread plates

Dilution and Plate Count (1)

Dilution and Plate Count (2)

Penghitungan mikrobia dalam bahan pangan Uji coliform dengan MPN Pencemaran air mengapa coliform ? Pengujian : Uji pendugaan (presumptive tests) Uji penetapan (confirmation tests) Uji lengkap (completed tests)

Air Keperluan sehari-hari dan industri Dari mana asal mo dalam air? - Udara, tanah, sampah - Tanaman & hewan (hidup dan mati) - Kotoran manusia dan hewan  sumber utama mo patogen dalam air Bagaimana mengetahui adanya mo patogen dalam air? - Tes tiap jenis m.o :lama, mahal, tidak praktis - Tes bakteri coliform  indikator cemaran  bakteri yang mirip dengan E. coli

Mengapa E. coli? Ada E. coli? E. coli: Gram negatif, tidak berspora, memfermentasi laktosa, pada EMB menghasilkan koloni tipikal Mengapa E. coli? - terdapat dalam jumlah besar pada feses hewan dan manusia - dapat hidup lebih lama di air dari bakteri intestin patogen yang lain Ada E. coli?  air terkontaminasi kotoran manusia/hewan mungkin mengandung bakteri patogen  kualitas air  polusi fekal Coliform : Tipe fecal (E. coli); Non fecal (Aerobacter aerogenes: feses, tanah)

TOTAL COLIFORMS COLIFORM BACTERIA ESCHERICHIA ENTEROBACTER KLEBSIELLA CITROBACTER

TOTAL COLIFORMS GENERALLY CALLED MARKER ORGANISMS INDICATOR COLIFORM BACTERIA ORGANISMS INDICATE INSUFFICIENT HYGIENE DURING A PROCESS/PRODUCTION INDEX E.COLI INDICATES A ORGANISMS POTENTIAL HAZARD TO HEALTH DUE TO FECAL CONTAMINATION

Interpretation of Results Laurylsulfate Tryptose Broth E.coli Indole + , Gas + Coliforms Indole - , Gas +

Prosedur pengujian total coliform dengan metode MPN (FDA, 1995)

Detection of Coliforms Gas + Acid from Lactose 95 % of Coliforms Gas + Acid from Lactose at 44°C ONLY 90 % of E.coli Tryptophanase 99 % of E.coli are Indole positive

PENGECATAN GRAM Warna yang ditimbulkan selama proses pengecatan gram Sel-sel pada gelas preparat Cat utama crystal violet Warna ungu Warna ungu Mordan, Gram Iodin Tetap ungu Tetap ungu Peluntur cat, Alkohol Menjadi tidak berwarna Tetap ungu Cat penutup (lawan), Safranin Tetap ungu Merah muda

Mikroskop dan Staining

MORFOLOGI JAMUR Pengamatan morfologi jamur dengan mikroskop: Hifa: bersepta atau tidak, transparan atau keruh, berwarna atau tidak, jika ya, tentukan warnanya! 2. Spora seksual: oospora, askospora, basidiospora, atau yang lain. 3. Spora aseksual: sporangiospora, konidiospora,arthrospora, atau yang lain. Tentukan bentuk, struktur, dan ukuran. 4. Badan buah: sporangium, bentuk, warna, ukuran, dan letak. Bila menghasilkan konidia, tentukan tipe, ukuran, letak metula, fialida, uniseriate, biseriate, atau mono-, bi-, ter-, quarter-versilata, beraturan atau tidak. Struktur morfologi pada Aspergillus Conidia Fialida Metula Vesikel Stipa Spora seksual

5. Dasar badan buah: berupa kolumela, vesikula, tentukan bentuk dan ukuran! 6. Pendukung badan buah: tunggal atau dalam bentuk berkas, bercabang atu tidak? 7. Bentuk-bentuk khusus: misalnya stolon, rhizoid, sel kaki, apofisa, khlamidospora, atau bentuk khusus lainnya.

Terima kasih