Teknik Analisis Fragmen DNA Sebagai Dasar REKAYASA GENETIKA Win Darmanto, Ph.D. Laboratorium Biologi Reproduksi Jurusan Biologi, FMIPA UNAIR

virus dengan lamda phage Fenomena di alam, virus dengan lamda phage menginsertkan genomnya ke dalam kromosom sel Escherichia coli (sebagai lysogenic conversion) Terjadi perubahan fenotip E. coli. Berupa menjadi pathogen atau berubah menjadi bakteri yang produktif.

Definisi : Adalah suatu usaha membuat rekombinan baru, dengan cara menyusupkan asam nukleat / DNA dari sel lain, ke dalam suatu sel baru / host melalui bantuan suatu vektor. Sel hasil rekombinan mempunyai sifat genetik sama dengan sel donor.

Tehnologi DNA meliputi :. Kloning DNA,. Analisis DNA/ RNA Tehnologi DNA meliputi : Kloning DNA, Analisis DNA/ RNA Transplantasi gen Transformasi dan Kloning organisme. Tehnologi DNA dimanfaatkan dalam bidang kedokteran, farmasi, forensik, lingkungan dan penerapan di bidang pertanian.

Tahapan teknik dasar dalam cloning gen : 1. Isolasi DNA / RNA 2 Tahapan teknik dasar dalam cloning gen : 1. Isolasi DNA / RNA 2. Pemotongan, penyambungan / insersi DNA / RNA. 3. Memantau hasil pemotongan atau penyambungan DNA / RNA. 4. Transformasi pada sel host (E. coli). 5. Isolasi DNA rekombinan dari host. 6. Analisa DNA rekombinan.

Plasmid dapat berperan sebagai vektor kloning. Tehnologi DNA dapat digunakan untuk menggabungkan dan mengkopi beberapa gen. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular berukuran kecil umumnya berasal dari bakteri, sering dianggap sebagai ektrakromosom. Enzym restriksi, merupakan enzym yang digunakan untuk memotong plasmid, maupun gen (hewan atau tumbuhan) agar keduanya dapat disambungkan. Plasmid dapat berperan sebagai vektor kloning. Enzym restriksi hanya mampu memotong pada urutan basa DNA tertentu, atau disebut sisi restriksi.

Dengan enzym restriksi dapat menghasilkan potongan DNA dengan bentuk sticky ends (ujung lancip) sehingga mampu berpasangan dengan basa yang cocok/sesuai. Enzym ligase digunakan untuk menyambung gen yang diinsertkan (hewan atau tumbuhan) dengan potongan plasmid melalui ikatan kovalen, sehingga dihasilkan DNA rekombinan. Umumnya gen hewan yang diinsertkan berada diantara gen lacZ (sebagai gen penanda). Biasanya plasmid (vektor) juga membawa gen yang resistan terhadap antibitik (ampisilin).

ENZYM RESTRIKSI Enzym restriksi digunakan untuk pemotongan molekul DNA. Escherichia coli R G A *A T T C (ECO RI) C T T A* A G Haemophilus Influenzae d AAGCTT (Hind III) TTCGAA Haemophilus aegyptus GGCC (Hae III) CCGG

Hasil Potongan Enzym Restriksi Contoh ujung lengket : AAATTC TTTAAG Contoh yang tumpul : GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG

Sel bacteri mampu mengambil plasmid rekombinan yang terdapat pada media/larutan disekitarnya (dimana bakteri dikultur), sehingga diperoleh transformasi (masuknya gen asing ke dalam bakteri). Setelah bakteri dikultur pada medium bakteri akan tumbuh, plasmid akan mengalami replikasi bersama sama dengan replikasi DNA bakteri, sehingga diperoleh klon atau kopi dari rekombinan plasmid. Keberhasilan rekombinan ini dapat diketahui dengan tumbuhnya bakteri pada medium yang ditambah ampisilin sebagai media seleksi (karena rekombinan disertai gen resistan ampilin). Sedangkan sel bakteri yang tidak berhasil mengambil rekombinan akan mati dalam medium ampisilin.

Contoh Hasil potongan DNA oleh Enzyme restriksi

Sel bacteri mampu mengambil plasmid rekombinan yang terdapat pada media/larutan disekitarnya (dimana bakteri dikultur), sehingga diperoleh transformasi (masuknya gen asing ke dalam bakteri). Setelah bakteri dikultur pada medium bakteri akan tumbuh, plasmid akan mengalami replikasi bersama sama dengan replikasi DNA bakteri, sehingga diperoleh klon atau kopi dari rekombinan plasmid. Keberhasilan rekombinan ini dapat diketahui dengan tumbuhnya bakteri pada medium yang ditambah ampisilin sebagai media seleksi (karena rekombinan disertai gen resistan ampilin). Sedangkan sel bakteri yang tidak berhasil mengambil rekombinan akan mati dalam medium ampisilin.

Penyambungan Mol DNA. 1. DNA Ligase bakteri, untuk menyambung ujung lengket. 2. DNA Ligase dari E.Coli, yang diinfeksi bakteriofage T4, disebut T4 Ligase, menyambung ujung tumpul maupun lengket. 3. Enzym terminal deoksinukleotidil transferase untuk mensitese homo polimer pada ekor ujung 3’ utas tunggal sehingga menghasilkan ujung lengket, sehingga jika ditambah enzym ligase dapat disambung.

Plasmid yang ideal harus mempunyai sifat : 1. Berukuran kecil 2 Plasmid yang ideal harus mempunyai sifat : 1. Berukuran kecil 2. Mudah diseleksi sifat fenotipnya 3. Mudah dipotong (cocok) oleh beberapa enzym restriksi Cara masuknya plasmid ke dalam sel inang baru umumnya melalui proses konjugasi, selanjutnya di dalam sel inang baru plasmid mengalami replikasi. Lamda Bakteriofaga (Faga): Merupakan virus dari Escherichia coli , molekul DNA dalam bentuk linier, double stranded, berukuran 48,5 kilobase (Kb). Dapat dirubah menjadi bentuk cicin (melingkar).

Vektor Potongan DNA yang digunakan menyisipkan potongan DNA asing (DNA donor) ke dalam sel atau DNA resipien. DNA asing yang mudah di pindahkan ke organisme inang baru dan dapat diekspresi dan replikasi oleh organisme yang ditempati, bersama-sama DNA inang baru. Vektor yang sering digunakan adalah : Plasmid : ekstrakromosom dari bakteri (double stranded) Bakteriofaga: virus lamda, untai tunggal Cosmid : plasmid yang dimodifikasi menjadi bentuk lingkar. Phasmid : hasil silang antar plasmid dan faga (vektor sintetik)

DNA virus (biasanya bacteriophage) Masuk host cell Berintegrasi dengan kromosom DNA virus cepat men host sehingga DNA virus ikut replikasi, tanpa berintegrasi ke dalam mengalami replikasi. kromosom host. Jalur lisogenik Sel host lisis, DNA virus terlepas sel host tidak lisis Jalur lysis DNA virus (biasanya bacteriophage)

Mekanisme transformasi : Kalsium Klorida  sel membengkak. dan merusak protein poriplasmik. Dinding sel menjadi bercelah DNA yang ditambahkan membentuk complex resisten DNASe Komplex DNA akan diambil oleh sel pada saat pemanasan tiba – tiba.

Digunakan gel agarose atau gel poliakrilamide, untuk elektroferesis. ANALISIS POTONGAN DAN PENYAMBUNGAN DNA Digunakan gel agarose atau gel poliakrilamide, untuk elektroferesis. Gel agarose : mampu memisahkan sample DNA dari ratusan bp sampai 20.000 bp. Gel Poliakrilamide : memisahkan sample DNA yang lebih kecil. DNA adalah bermuatan negatif, pada media elektrik akan bergerak ke elektroda positif.

Jika berbagai ukuran molekul DNA dimasukkan dalam gel agarose, dan aliran listrik dijalankan melalui gel, maka molekul DNA akan bergerak melalui gel, dengan kecepatan tergantung ukuran fragmen.

Molekul yang kecil akan bergerak lebih cepat daripada molekul besar. Untuk memonitor pergerakan molekul DNA, agarose ditambah dengan pewarna Etidium bromide. Sehingga band dari molekul DNA akan berwarna biru. Selesai elektroforesis, gel diamati dibawah sinar UV, band akan tampak berfluorescense.  selanjutnya di foto.

Pandangan Samping Electroforesisi tutup -ffffff Gel agarose buffer Electrode + Electrode - Pandangan Samping Electroforesisi

Sumur gel untuk sample DNA Kawat electrode (-) Sumur gel untuk sample DNA Marker DNA Kawat electrode (+) Pandangan Atas Gel

Dengan elektroforesis, gel agarose juga dapat untuk mengisolasi fragment DNA. Ada beberapa cara : Memotong gel yang mengandung fragment, selanjutnya fragment DNA dilarutkan atau dipisahkan gel. Fragment DNA dipindahkan ke kertas DEAE Selulosa, dengan jalan kertas selulosa disisipkan di dekat fragment, sehingga fragment yang berjalan akibat elektroforesis akan terhambat dan menempel pada kertas selulosa.

Fragmen DNA Arah electroforesis Sumur Membrane selulose Setelah Fragmen DNA menempel di membran selulose, berikutnya diresuspensi

SOUTHERN BLOTTING Suatu metode yang digunakan untuk analisis molekul DNA Untuk identifikasi gen tertentu pada fragmen atau identifikasi sekwen DNA yang berkaitan / dihibridisasi dengan molekul RNA tertentu. Dikembangkan oleh Southern (1975)

Dihisap dari bawah (Blooting) Gel hasil elektroforesis dalam analisis mRNA diletakkan di atas membrane nitroselulose Dihisap dari bawah (Blooting) Nitroselullose mengandung fragmen DNA Dihibridisasi dg Probe cDNA yang telah dilabel (Isotop/Flourescence)

Hibridisasi Fragmen DNA dengan Probe cDNA Fragmen SingleStrand DNA T A C G G G A A T G C C C T Probe yang cocok untuk Single strand DNA Label isotop atau fluoroscense

Probe PROBE adalah complementary DNA (cDNA) yang sudah dilabel dengan isotop (misal dengan carbon atau phospor) atau dilabel dengan fluorescense. Jika labelnya isotop maka DNA yang dideteksi akan menampakkan radiasi untuk bisa membakar film yang akhirnya dapat dicuci cetak. Jika labelnya fluorescense, DNA akan menampakkan warna fourescense.

Gambaran Gel Hasil Hibridisasi film yg terexpose isotop / probe Nitro cellulose dg fragmen DNA Hibridisasi Probe expose film *) Tebal tipisnya band mengetahui kadar ekspresi gen. *) Posisi band mengetahui panjang pendeknya rantai DNA (base pair / bp).

Analisis Molekuler lainnya Northern Blotting untuk mengisolasi mRNA Western Blotting untuk mengisolasi Protein Insitu Hibridisasi: untuk mengisolasi mRNA Pada sayatan histologis (dengan probe cDNA) Imunohistochemistry : untuk mengisolasi protein pada sayatan histologis (dengan Antibodi)

Gambar Teknik / Alat Southern Bloting