TEKNIK PENYIAPAN SAMPEL (KIMIA FARMASI ANALISIS I) Oleh Purwadi, M.Si UNIVERSITAS TULANG BAWANG BANDAR LAMPUNG, 2008

Purwadi, S.Si. M.Si. Graduated from: Master of Science with Cume Laude, School of Pharmacy - Institut Tecnology of Bandung, 2007 Bachelor of Science in Chemistry, University of Lampung, 1999 Works: NQCLDF in Bandar Lampung, Deputy of Technical Manager - Testing Laboratoria for Therapeutics, Narcotics, Traditional Drugs, and Complement Product Supervisor for Cosmetic testing Laboratory

Rekayasa bioteknologi Alam Semisintesis Sintesis kimia Obat Pencegahan Diagnosis Pengobatan Pemulihan Peningkatan kualitas hidup Senyawa anorganik Senyawa organik Struktur molekul (kimia) Aktivitas biologi (farmakologi) Berdasar: Unsur /ion Gugus fungsi Rangka utama Ikatan kimia Kerja obat dalam tubuh

Analisis bedasarkan tujuan: Kualitatif: Penentuan Identitas Senyawa Kuantitatif: Penentuan Jumlah/Kadar Prepapatif: Mendapatkan/memurnikan Analisis berdasarkan metode/teknik: Fisika Kimia Fisikokimia Mikrobiologi Makrobiologi dll

Analisis berdasarkan kerumitan matrik Langsung: > pada senyawa murni > pada analisis senyawa spesifik > matriks tidak mengganggu Tidak langsung/pemisahan > Terdapat matrik yang mengganggu analisis > terdapat analit lain

Matriks mengganggu => > Lakukan pemisahan analit terhadap matriks Rusak matriks tsb Perlu pernyiapan / preparasi sampel Alasan lain preparasi: Menurunkan batas deteksi  dengan pemekatan / prekonsentrasi

Tahap-tahap umum penyiapan sampel

Teknik- Teknik Preparasi Sampel: Penggerusan / blender / cincang pada: sampel padat atau sampel dengan matriks padat tujuan: memperluas permukaan kontak Penyaringan pada: analit dengan pengotor partikel terdispersi

c. Sentrifugasi pada : pada analit dengan matriks partikel padat terdispersi tujuan: matriks mengendap d. Pemekatan dengan gas Nitrogen (gas inert) pada: analit dengan pelarut yang dapat menguap Tujuan: pemekatan analit karena pelarut berkurang

Penguapan pelarut dengan nitrogen Gas N2 bersifat inert

Pemekatan / pemisahan dengan Destilasi kapan: - jika yang dipisahkan campuran cairan - titik didih rendah - atau jika analit atau matriks, salah satunya volatil - perbedaan titik didih antar zat yang ingin dipisahkan cukup jauh - zat yang akan didestilasi stabil terhadap panas

Destilasi dibagi: Destilasi Sederhana Destilasi Vakum Destilasi Fraksionasi Destilasi uap Destilasi bertingkat Destilasi Azeotrop

Destilasi Sederhana Destilasi pada awal perkembangan

Destilasi Sederhana

Laboratory distillation setup: 1: Heat source 2: Still pot 3: Still head 4: Thermometer /Boiling point temperature 5: Condenser 6: Cooling water in 7: Cooling water out 8: Distillate/receiving flask 9: Vacuum/gas inlet 10: Still receiver 11: Heat control 12: Stirrer speed control 13: Stirrer/heat plate 14: Heating (Oil/sand) bath 15: Stiring means e.g. magnetic follower (shown), anti-bumping granules or mechanical stirrer 16: Cooling bath.

Pada distilasi sederhana, semua uap panas yang dihasilkan dilewatkan melalui Kondenser / pengembun yang akan mendinginkan dan mengembunkan uap. Destilat / hasil destilasi tidak akan murni, komposisinya akan identik dengan komposisi uap pada suhu dan tekanan yang diberikan, atau dapat dihitung dengan hukum Raoult.

Hukum Raoult: tekanan uap dari larutan ideal adalah tergantung pada tekanan uap dari masing-masing senyawa kimia dan fraksi mol dari senyawa-senyawa yang ada dalam larutan tersebut.

Destilasi Fraksinasi

Destilasi Azeotrop

Destilasi Vakum Pada tekanan rendah cairan akan mendidih pada suhu lebih kecil Tekanan berbanding terbalik dengan suhu

Destilasi Vakum Rotary Vacuum evaporator: Digunanakan untuk mendestilasi pelarut lrbih cepat pada temperatur lebih rendah, karena menggunakan vakum

Perkin Triangle Distillation Setup 1: Stirrer bar/anti-bumping granules 2: Still pot 3: Fractionating column 4: Thermometer/Boiling point temperature 5: Teflon tap 1 6: Cold finger 7: Cooling water out 8: Cooling water in 9: Teflon tap 2 10: Vacuum/gas inlet 11: Teflon tap 3 12: Still receiver

refluks

f. Metode Ekstraksi Tujuan: - pemisahan - prekonsentrasi - preparasi solute pada medium yang dikehendaki - penentuan analit secara analitik.

Ekstraksi merupakan distribusi solute diantara dua fase larutan yang tidak saling bercampur satu dengan yang lain hingga tercapainya kesetimbangan. Fase yang satu umumnya adalah fase air dan yang lain sebagai fase organik.

Ekstraksi berdasarkan kontak antar fase: 1. Ekstraksi satu tahap misal: ECC 2. Ekstraksi Sinambung misal: sokletasi 3. Ekstraksi Lawan arus

Ekstraksi pelarut sering disebut juga Distribusi Cair Cair atau Ekstraksi Cair Cair (ECC). [A]Org [A]Aq Fase kontak satu kali Kedua cairan tidak saling larut/bercampur

Konstanta Distribusi Konstanta distribusi (Kd) dikemukakan oleh Nernst, 1898, sebagai nilai yang dapat mendeskripsikan data hasil ekstraksi Konsentrasi solute pada masing-masing solven ditentukan pada saat distribusi solute pada 2 solven tersebut mencapai kesetimbangan. [A]organik Kd = ------------ [A]air

Ekstraksi dipengaruhi oleh Kelarutan (K oktanol-air atau log Koktanol-air) pKa atau pKb

Koefisien partisi oktanol–air (Kow) beberapa senyawa organik

Konstanta disosiasi (pKa) beberapa zat organik

Ekstraksi sinambung; Jika ekstraktan lebih ringan E: ekstraktan: pelarut pengekstraksi R : rafinat: larutan yang ada analitnya

Ekstraksi sinambung; Jika rafinat lebih ringan E: ekstraktan: pelarut pengekstraksi R : rafinat: larutan yang ada analitnya

Peralatan ekstraksi sinambung disain untuksampel dimana pelarut pengekstrak lebih besar dibanding air

Peralatan ekstraksi cair-cair sinambung, disain untuk sanpel dimana solven pengekstrak lebih berat dibanding air Dengan sistem ekstraksi dan pemekatan pada satu peralatan .

Ekstraksi Fase Padat (SPE)

Ekstraksi dengan ultrasonik

g. Clean Up sampel dengan kromatografi kolom

h. SOKLETASI Merupakan teknik ekstraksi sinambung menggunakan panas Menggunakan panas => senyawa analit harus termostabil Kelarutan antara ekstraktan Vs analit perlu diperhatikan Ekstraktan pilih yang mempunyai titik didih relatif rendah

1: Stirrer bar/anti-bumping granules 2: Still pot (extraction pot) - still pot should not be overfilled and the volume of solvent in the still pot should be 3 to 4 times the volume of the soxhlet chamber. 3: Distillation path 4: Soxhlet Thimble 5: Extraction solid (residue solid) 6: Syphon arm inlet 7: Syphon arm outlet 8: Expansion adapter 9: Condenser 10: Cooling water in 11: Cooling water out http://en.wikipedia.org/wiki/Soxhlet

h. Rekristalisasi: metode pemurnian kristal dengan cara pelarutan dan pengkristalan ulang A. Rekristalisasi dengan pelarut tunggal → Solvent added (clear) to compound (orange) → Solvent heated to give saturated compound solution (orange) → Saturated compound solution (orange) allowed to cool over time to give crystals (orange) and a non-saturated solution (pale-orange).

B. Rekristalisasi multi-pelarut Tanpa pemekatan → Solvent added (clear) to compound (orange) → Solvent heated to give saturated compound solution (orange) → Second solvent (blue) added to compound solution (orange) to give mixed solvent system (green) → Mixed solvent system (green) allowed to cool over time to give crystals (orange) and a non-saturated mixed solvent system (green-blue).

Rekristalisasi penyaringan panas → Solvent added (clear) to a mixture of compound (orange) + insoluble substance (purple) → Solvent heated to give saturated compound solution (orange) + insoluble substance (purple) → Saturated compound solution (orange) filtered to remove insoluble substance (purple) → Saturated compound solution (orange) allowed to cool over time to give crystals (orange) and a non-saturated solution (pale-orange).

Perlu pemekatan → First solvent added (clear) to compound (orange) → Solvent heated to give saturated compound solution (orange) → Second solvent (blue) added to compound solution (orange) to give first mixed solvent system (green) → Volatile first solvent (clear) is removed (e.g. evaporation) from first mixed solvent system (green) to give a second mixed solvent system (dark-green) → Second mixed solvent system (dark-green) allowed to cool over time to give crystals (orange) and a non-saturated second mixed solvent system (green-blue)

Penyiapan sampel volatil untuk GC secara headspace

Prinsip pemisahan secara membran permeabel Membran mempunyai pori dengan ukuran tertentu Analit akan bermigrasi dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi lebih rendah Hanya analit dengan ukuran tertentu yang akan melewati membran

Ekstraksi dengan membran

Metode digesti: Digunakan untuk analisis logam pada matriks organik kompleks Bagaimana: matiks rusak, analit (logam) tidak rusak Basah : dengan H2SO4, HNO3, HCl, H2O2, dll Kering: tanur, pengabuan , mikrowave dll Gabungan basah/kering

Presipitasi Untuk pengendapan matriks biologi: Lakukan presipitasi pada sampel darah Dengan penambahan metanol, etanol, kloroform, asam perklorat, dll Mengapa: 1. matriks berupa biomolekul berupa protein akan terdenaturasi / mengendap 2. Ikatan antara analit dengan protein akan putus

Pustaka: Miller, J.M. 1975. Sparation Methods in Chemical Analysis. John Willey & Sons. New York. J D. WINEFORDNER (ed.). 2003. Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. VOL. 162. A JOHN WILEY & SONS, INC., PUBLICATION www.wikipedia.com Bocxlaer, J. Van , 2007. Drug Analysis. 5th EACPT Summerschool Clinical Pharmacology & Therapeutics, UZ Gent.