m.K. Dasar Teknologi Mikrobial TIN 232 2(2-0) “KEBUTUHAN NUTRISI DAN PERANCANGAN & PENYIAPAN MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA” Departemen Teknologi Industri Pertanian FATETA IPB 2011

SKEMA PROSES MIKROBIOLOGIS (FERMENTASI/KULTIVASI) Proses Hulu Penyiapan Inokulum Mikroba Penyiapan/ formulasi Media Sterilisasi Inokulasi secara aseptik Perakitan dan strerilisasi bioreaktor Proses Hilir Fermentasi (Pengontrolan : suhu, pH, aerasi, agitasi dan busa) Pemanenan & Pemurnian Analisis hasil fermentasi Sampling

Pertumbuhan mikroba memerlukan : a. Lingkungan fisik (suhu, pH, efek mekanis/agitasi dan Aw) harus terpenuhi agar mikroba dapat tumbuh b..Senyawa kimiawi sbg nutrisi (sumber karbon, sumber nitrogen dll dan O2 terlarut) Perlu media kultur yang sesuai (media = nutrien yang dipersiapkan untuk pertumbuhan mikroba di laboratorium/industri) Pemahaman dan pengaturan sumber nutrisi dapat pula digunakan untuk seleksi, identifikasi dan mempelajari mikroba spesifik

MEDIA KULTUR Kegunaan  Untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroba, sehingga diperoleh produk yang diinginkan Fungsi utama media : Sumber energi Bahan pembangun sel Akseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi)

Syarat Media : 1. Mengandung semua nutrisi yang dibutuhkan : sumber C, sumber N, garam mineral dan faktor pertumbuhan (growth factor = nutrien organik esensial yang tidak diproduksi oleh mikroba, sehingga harus diberi suplemen, contoh : asam amino, vitamin) 2. Kondisi media harus sesuai dengan sifat fisiologis mikroba (misalnya suhu, pH, kekentalan media dan tekanan osmosis) 3. Media harus dalam keadaan steril, sehingga tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain Persamaan reaksi : C + N + Lain-lain  sel mikroba + produk + CO2 + H2O + panas

Klasifikasi Nutrisional Mikroba : Organisme dapat menggunakan sumber energi : senyawa kimia  kemotrof cahaya  fototrof Organisme dapat menggunakan sumber karbon : senyawa anorganik (CO2) ototrof (self-feeders) senyawa organik (gula, protein, lemak)  heterotrof (tergantung dari bentuk kehidupan lain) (tabel klasifikasi nutrisional) Beberapa spesies mikroba tidak mengikuti klasifikasi nutrisional tsb, contoh : Rhodospirillum rubrum bersifat fotoheterotrof, tetapi bila ada O2, dapat bersifat kemoheterotrof

Seny. Anorganik sederhana Klasifikasi Nutrisional Bakteri & Organisme Lain Kelp. Nutrisi Sumber Energi Sumber Karbon Contoh Kemoototrof Seny. Anorganik sederhana CO2 Bakteri nitrifikasi, hidrogen, besi & sulfur Kemohetero-trof Seny. Organik Seny Organik Kebanyakan bakteri, fungi, protozoa & hewan Fotoototrof Cahaya Bakteri sulfur ungu & hijau, alga, Cyanobacteri & tanaman Fotohetero-trof Bakteri non sulfur ungu & hijau  Digunakan secara luas untuk taksonomi bakteri dan khamir

NUTRISI MIKROBA Nutrisi yg diperlukan sel mikroba terdiri atas : Unsur Makro (macronutrients) : unsur C, O, N, H, P, S, Mg2+ , K+.  diperlukan pd konsentrasi ≥ 10-4 M. Unsur Mikro (micronutrients/trace elements) ; Mo2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+, Ca2+, Na+, vitamin, hormon pertumbuhan, dan prekursor

Peran Unsur Makro Unsur Fungsi Fisiologis C N H O S P K Mg Kebutuhan (M) C N H O S P K Mg Konstituen bahan organik sel. Sering sebagai sumber energi Konstituen protein, asam nukleat, koenzim Bahan organik sel dan air Bahan organik sel dan air. Diperlukan pd respirasi aerobik. Konstituen protein dan bbrp koenzim Konstituen asam nukleat, fosfolipida, nukleotida, dan bbrp koenzim Kation anorganik dlm sel, dan kofaktor bbrp enzim Kofaktor utk banyak enzim dan klorofil. Ada pd dinding sel dan membran. >10-2 10-3 - 10-4 10-4--10-3

Unsur Mikro Kekurangan unsur kelumit (trace elements) menyebabkan fase lag lebih panjang, menurunkan laju pertumbuhan spesifik (μ) dan rendemen produk. Tiga kategori unsur kelumit: Unsur kelumit yg paling banyak diperlukan adalah Fe, Zn, dan Mn  merupakan kofaktor penting. Unsur kelumit yg diperlukan utk pembentukan produk-produk spesifik, adalah Cu, Co, Mo, Ca, Na, Cl, Ni, dan Se. Unsur kelumit yg jarang dibutuhkan, spt B, Al, Si, Cr, V, Sn, Be, F, Ti, Ga, Ge, Br, Zr, W, Li, I.  penggunaan harus diperhatikan karena toksik pd konsentrasi ≥ 10-4 M.

Sumber Karbon Setelah diuraikan menjadi molekul yang lebih kecil, sumber karbon digunakan sebagai bahan dasar sintesis polisakarida, protein, lipida dan asam nukleat. Jenis dan konsentrasi sumber karbon mempengaruhi pertumbuhan dan pembentukan produk  umumnya glukosa lebih baik dibandingkan jenis gula lain Bahan penyusun utama sel mikroba (±50 % bobot kering)

Jenis sumber karbon : Karbohidrat : bahan yang mengandung pati (jagung, tapioka, kentang, dll) atau bahan yang mengandung gula (molase/tetes tebu, whey dll). Minyak tumbuhan (minyak kelapa sawit, minyak jagung, minyak biji kapas, minyak kedelai, dll). Alkohol dan asam organik sederhana  proses hilir (pemanenan hasil) lebih sederhana. Metan dan metanol untuk produksi Protein Sel Tunggal (PST) n-alkana (C12-C18) untuk produksi asam organik, asam amino, antibiotik, dll.

Dasar pemilihan sumber C (karbon) dalam industri a.l : - Kemudahan diuraikan oleh mikroba  semakin sederhana, semakin mudah dikonsumsi oleh mikroba - Kemudahan penanganan  tidak mengandung zat pengotor & siap digunakan Contoh : gula rafinasi bebas ion logam untuk produksi asam sitrat  toksik - Ketersediaan  mudah diperoleh setiap saat, tidak musiman - Harga  pada industri etanol dan PST biaya sumber karbon sangat besar

SUMBER NITROGEN Nitrogen digunakan sebagai bahan dasar untuk sintesis protein, asam nukleat dan vitamin Jenis dan konsentrasi sumber nitrogen mempengaruhi pertumbuhan dan pembentukan produk. Contoh produksi antibiotik dihambat oleh sumber N yang mudah dikonsumsi mikroba Jenis sumber N : N anorganik : garam ammonium atau nitrat, gas amoniak N organik : hidrolisat protein, asam amino, urea, corn steep liquor, tepung kedelai, tepung ikan, ekstrak khamir dll

Sumber N dapat mempengaruhi pH kultur penting diketahui saat pemilihan sumber N, contoh : Garam ammonium menurunkan pH,karena ion NH4+ bergabung dengan sel mikroba dan melepaskan H+ Gas ammoniak (NH3 ) & nitrat  pH meningkat Ammonium nitrat mula-mula menurunkan pH saat ammonia dikonsumsi, selanjutnya pH meningkat saat nitrat dikonsumsi Urea  Mempunyai buffering capacity yang sangat baik

GARAM MINERAL Sulfur (dalam bentuk NH4SO4) digunakan sebagai koenzim, asam amino dan komponen sel lainnya. Fosfor (dalam bentuk K2HPO4 dan KH2PO4) digunakan sebagai bahan asam nukleat, fosfolipida, ATP dan buffer K, Mg, Mn, Fe dan Ca berfungsi sebagai kofaktor enzim selain untuk pertumbuhan, Fe juga merupakan bagian dari sitokrom, Ca dipakai dalam pembentukan spora. Unsur Kelumit (trace element) : Co, Mo, Zn dan Cu merupakan bagian dari enzim tertentu.

Unsur Mikro (mikronutrien/trace elements) Beberapa ion : contoh Mg2+, Fe3+, dan PO43-, dapat mengendap dalam media  diperlukan bahan pengkelat (chelating agent) Bahan pengkelat mempunyai “ligand” (spt gugus karboksil, amin, mercapto) utk mengikat ion logam  membentuk senyawa kompleks yg larut dalam air Contoh Bahan Pengkelat : Asam sitrat, EDTA, polifosfat, histidin, tirosin, dan sistein

Bahan pemula (prekursor) sintesis suatu senyawa, karena tidak dapat disintesis oleh mikroba sendiri, contohnya : - purin atau pirimidin untuk sintesis asam nukleat - -alanin untuk sintesis asam pantotenat Vitamin, contohnya : - biotin untuk produksi MSG - Ca-pantotenat untuk produksi cuka Induser untuk produksi enzim, contoh : - pati pada produksi α-amilase - berbagai protein pada produksi protease

Anti Busa Kebanyakan proses mikrobiologis menghasilkan busa yang umumnya diakibatkan oleh protein yang terdenaturasi pada antarmuka udara-cairan fermentasi Terjadinya busa dapat menyebabkan sel terlempar dari media  otolisis yang melepaskan protein Cara mengatasi : - alat pemecah busa atau - Melakukan pemurnian parsial nutrien kompleks dan memodifikasi parameter fisik (pH, suhu, aerasi dan agitasi) untuk pembentukan busa oleh komponen media  aplikasi terbatas - Busa tidak dapat dicegah, sehingga diperlukan senyawa antibusa (silikon, asam lemak & turunannya, poli propilen glikol, sulfonat dll)  kelemahan : menurunkan laju transfer oksigen, shg hrs digunakan minimal

METODE PREPARASI MEDIA Media yang dibeli dalam bentuk komersil, misalnya nutrient agar, nutrient broth  biasanya resepnya tertulis di kemasan. Tinggal mengikuti resep tersebut Jika dalam media terdapat sumber nitrogen/ protein, maka saat sterilisasi, pisahkan antara sumber karbon dengan nitrogen karena dapat menyebabkan reaksi browning (pencoklatan)  sumber C tidak dapat digunakan lagi oleh m.o Jika berupa pati, maka konsentrasinya maksimal 2% karena dapat menggumpal jika dipanaskan.

BAHAN DASAR MEDIA PERTUMBUHAN BAKTERI Nutrient agar : - beef extract 3 g - pepton 5 g - agar 15 g - air 1000 g Nutrient broth: Agar miring (media padat) Propagasi (media cair)

BENTUK KOMPOSISI & JENIS MEDIA Dipengaruhi oleh jenis mikroba yang digunakan, senyawa penyusun media, komposisi campuran dan tujuan penggunaannya BENTUK MEDIA Media Padat : ditambah agar ± 1,5 % (b/v)  agar miring & substrat padat  onggok, sekam dll Media Cair (tidak menggunakan agar)  propagasi & fermentasi substrat cair Media Semi Padat (menggunakan agar sebanyak 50 % atau kurang dari jumlah agar yang digunakan pada media padat)  untuk pengujian sifat fisiologis mikroba

Bahan baku untuk media merupakan komponen utama biaya produksi (dapat mencapai 70 %) Media dapat berpengaruh terhadap : - Pertumbuhan dan pembentukan produk - Perubahan pH selama fermentasi - Pembentukan busa - Bentuk morfologi mikroba - Jenis fermentor yang digunakan atau sebaliknya. Substrat metanol memerlukan fermentor ICI (Imperial Chemical Industry : airlift/ loop reactor  sinambung dg pembuangan panas & gas) Substrat padat memerlukan fermentor baki (tray fermentor)

Kriteria Pemilihan Bahan Media Kultivasi : Biaya & Ketersediaan  murah, konsisten kualitasnya, dan tersedia sepanjang tahun (tidak musiman) Penanganannya mudah, baik dlm bentuk cair maupun padat, selama transportasi dan penyimpanan (misal pengaturan suhu, Rh dll)) Kebutuhan sterilisasi dan tidak terdenaturasi oleh panas Kemudahan formulasi, pencampuran, viskositas, aerasi, dan pembentukan busa selama kultivasi dan pemanenan Perolehan produk yg diharapkan (rendemen), laju produksi, efisiensi (produkl per gram substrat yg digunakan)

Jenis Media Khusus : Penggunaan media tidak hanya untuk pertumbuhan dan pengembangbiakan mikroba, namun juga untuk tujuan khusus, seperti isolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi isolat mikroba yang didapatkan 1). Media Selektif : Media yang hanya ditumbuhi oleh satu atau lebih jenis mikroba tertentu, tetapi menghambat atau mematikan mikroba lainnya. Contohnya “media SS” (Salmonella-Shigella untuk menumbuhkan bakteri Salmonella-Shigella)  lihat komposisi media - Metil biru pada media EMB  bakteri Gram (-) tidak tumbuh - Kristal violet pada media MacConkey's) - Konsentrasi NaCl tinggi (7 % pada media MSA) menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak dikehendaki

Contoh : Agar SS (agar Salmonella Shigella) SS Media Formula / Liter Beef Extract...............................................................................5 g Enzymatic Digest of Casein...................................................2.5 g Enzymatic Digest of Animal Tissue........................................2.5 g Lactose....................................................................................10 g Bile Salts................................................................................8.5 g Sodium Citrate.......................................................................8.5 g Sodium Thiosulfate................................................................8.5 g Ferric Citrate.............................................................................1 g Brilliant Green................................................................0.00033 g Neutral Red........................................................................0.025 g Agar......................................................................................13.5 g pH akhir : 7.0 ± 0.2 at 25°C

Agar SS (agar Salmonella Shigella) : media selektif didasarkan atas derajat penghambatan bakteri gram positif dengan menggunakan bile salts, brilliant green dan sitrat Perbedaan bakteri “enteric” (E.coli) :  laktosa Mampu memfermentasi laktosa menghasilkan asam + indikator neutral red terbentuk koloni warna merah Mikroba yang tak mampu memfermentasi latosa  membentuk koloni tak berwarna Contoh : mikroba patogen Salmonella dan Shigella. sodium thiosulfate dan ferric citrate  untuk mendeteksi pembentukan H2S (koloni dengan warna hitam di tengahnya)

Agar Salmonella Shigella

Media Selektif : Agar EMB E. coli mampu memfermentasi Laktosa  koloni hijau metalik pada Agar EMB E. aerogenes : koloni pink, sering spt mata ikan pada agar EMB Proteus vulgaris & Salmonella typhimurium (Gram -) tumbuh pd agar EMB tapi tdk bisa memfermentasi laktosa Staphylococcus aureus Gram (+) dihambat oleh eosin & metil biru (EMB) www.midlandstech.edu/.../sel_diff_media.html

2). Media Diferensial Media yang digunakan untuk membedakan antara jenis-jenis mikroba pada agar cawan. Contohnya : media Agar Darah untuk pertumbuhan bakteri hemolitik. 3). Media Penguji Media yang digunakan untuk pengujian senyawa tertentu dengan bantuan mikroba. Contohnya : media penguji antibiotika

4). Media Diperkaya (enrichment) Media yang digunakan untuk memberi kesempatan terhadap jenis mikroba tertentu untuk tumbuh dan berkembang biak lebih cepat dari mikroba lain. Contohnya untuk memisahkan bakteri penyebab penyakit tipus (Salmonella typhi) Enteric plating

Media Pertumbuhan Defined Media  mengandung jumlah tertentu senyawa kimia murni yang komposisinya diketahui. Contoh : glukosa, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgCl2.  Hasil kultivasi terkontrol dan reprodusibel. Complex media  mengandung senyawa alami yang komposisi kimiawinya tidak diketahui dengan pasti (kompleks).  Biasanya juga mengandung faktor pertumbuhan, vitamin, hormon, unsur kelumit, sehingga menghasilkan sel yang lebih banyak. Contoh : pepton, molase, ekstrak khamir, corn step liquor.

PRINSIP FORMULASI MEDIA Konstituen kimiawinya harus memenuhi kebutuhan dasar mikroba untuk : Pertumbuhan biomassa dan pembentukan produk Memasok energi untuk biosintesis dan pemeliharaan sel CARA : Analisis Komposisi Sel Komposisi sel mikroba menjadi dasar pedoman penyusunan media. Misalnya menentukan jumlah minimal N, S, P, Mg, dan K serta unsur kelumit (trace element) (Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Mo, B)

2) Analisis Stoikiometri untuk Pertumbuhan dan Pembentukan Produk Reaksi : Sumber C dan energi + Sumber N + Kebutuhan lain  biomassa sel + produk + CO2 + H2O + panas Secara kuantitatif dapat dihitung jumlah nutrien minimal untuk menghasilkan sejumlah biomassa atau jumlah substrat untuk menghasilkan sejumlah produk tertentu. 3) Kebutuhan Biokimiawi Spesifik Beberapa mikroba tidak dapat mensintesis nutrien spesifik tertentu (asam amino, vitamin, nukleotida), sehingga harus ditambahkan dari luar = “growth factor”. Contoh : khamir membutuhkan biotin, thiamin dan riboflavin

Komposisi Sel Mikroba Unsur Bakteri Khamir Kapang Karbon (C) 50 – 53 45 – 50 40 – 63 Hidrogen (H) 7 Nitrogen (N) 12 – 15 7.5 – 11 7 – 10 Fosfor (P) 2.0 – 3.0 0.8 – 2.6 0.4 – 4.5 Sulfur (S) 0.2 – 1.0 0.01 – 0.24 0.1 – 0.5 K 1.0 – 4.5 1.0 – 4.0 0.2 – 2.5 N 0.5 – 1.0 0.01 – 0.1 0.02 – 0.5 Ca 0.01 – 1.1 0.1 – 0.3 0.1 – 1.4 Mg Cl 0.5 - Fe 0.02 – 0.2 0.01 – 0.5 0.1 – 0.2

KOMPOSISI TIPIKAL Untuk M.O Unsur % bobot kering Karbon Nitrogen Fosfor Sulfur Magnesium 50 7-12 1-3 0.5-1.0 0.5 Sumber : Wang et al. (1978)

Contoh: Bila diinginkan mensintesis 30 g/L massa khamir, maka kira-kira formulasi media adalah sbb. Komponen media Konsentrasi (g/L) Sumber karbon : - Metanol - Etanol - Glukosa - Heksadekana (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 Trace element 60 40 30 12 1.3 1.5 10-4