MIKROBA INDUSTRI ISOLASI, SELEKSI & IDENTIFIKASI m.k Dasar Teknologi Mikrobial TIN 232 2(2-0) MIKROBA INDUSTRI ISOLASI, SELEKSI & IDENTIFIKASI Departemen Teknologi Industri Pertanian FATETA IPB 2012

MIKROBA INDUSTRI Mikroba  kunci keberhasilan suatu fermentasi/ kultivasi Kriteria Mikroba Industri : Merupakan galur murni Sifat genetiknya stabil Dapat menghasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduktif lain Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi Mampu menghasilkan produk yang diinginkan dalam waktu yang pendek & tidak menghasilkan produk sampingan yang toksik Mampu melindungi diri /bertahan thd. pengaruh lingkungan /kontaminan (pH, suhu, inhibitor) Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang Galur dapat dikembangkan kualitasnya (mutasi, rekayasa genetika), sehingga produksinya meningkat

Sumber Mikroba Sumber alami (tanah, air, tanaman/hewan, limbah dll) atau lembaga koleksi kultur  jumlah dan jenis mikroba sangat beragam Seleksi mikroba yang akan digunakan untuk industri : Isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni (semua sel dlm populasi identik & berasal dari sel induk yang sama  sifat morfologi & fisiologi seragam). Seleksi sehingga diperoleh galur dengan kinerja terbaik Identifikasi dengan menggunakan metode yang sesuai, sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebut  e.g Bergey's manual panduan membedakan spesies bakteri berdasarkan perbedaan fenotip isolat Mikroba yang telah diperoleh harus disimpan dengan teknik penyimpanan waktu yang panjang.

Identification Identification is the determination of whether an organism or isolate should be placed within a group of organisms known to fit within some classification scheme. Organisms are identified for practical purposes, such as diagnosis of disease

Identification Techniques : supplement Identification Techniques : Morphological identification (cell shape, cell size, endospore, flagella etc) Differential staining Use of differential media Serological methods [agglutination test, ELISA, Western blot)  antibodies are highly selective in terms of the proteins or other cell structures to which they bind, to the point that they are able to distinguish the proteins coming from one bacterial species among many species, or even one strain among many strain.

Comparisons of nucleotide sequences  16S gene DNA sequence supplement Flow cytometry (analyzes cells suspended in a liquid medium by light, electrical conductivity, or fluorescence as the cells individually pass through a small orifice.) 6. Phage typing (Phage can be very specific in what bacteria they infect and the pattern of infection by many phage may be employed in phage typing to distinguish bacterial species and strains.) Protein analysis (The size and other differences between proteins among different organisms may be determined very easily employing methods of protein separation using methods collectively known as gel electrophoresis.) Comparisons of nucleotide sequences  16S gene DNA sequence

Organisms are classified for scientific purposes. supplement Classification  describe the diversity of bacterial species by naming and grouping organisms based on similarities Placement of an organism within a scheme relating different types of organisms, such as that presented in Woese's universal tree Organisms are classified for scientific purposes. The science of classification is called taxonomy.

ISOLASI Isolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba di alam  sel individu terpisah Sebelum mengisolasi, harus diketahui : - mikroba apa yang akan diisolasi - habitat  menentukan sampel apa yang akan diambil dari alam , lokasi dan media apa yang akan digunakan

Metode Pengambilan Contoh Contoh berupa padatan (tanah, serpihan batu, kayu dll) :  Diambil dengan menggunakan spatula atau pinset steril  Penyimpanan menggunakan kantong plastik steril Contoh berupa cairan atau semi cair (air, lumpur dll) :  Diambil menggunakan pipet steril  Penyimpanan contoh menggunakan botol atau tabung polipropilen steril Contoh segera dibawa ke laboratorium (bila jarak jauh, gunakan es batu pada wadah penyimpanan) Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)

Teknik Isolasi Kultur Murni : - 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate) - 2. Penuangan (Pour-plate) - 3. Kultur Yang Diperkaya (Enrichment Culture) - 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution) - 5. Isolasi Sel Tunggal

Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate) Umumnya digunakan untuk memperoleh kultur murni mikroba yang tidak berhasil ditumbuhkan pada media padat dan hanya dapat tumbuh pada media cair Untuk bakteri paling sesuai  menggunakan agar cawan Sampel Pengenceran berseri dg larutan garam fisiologis (0,85 %) Penggoresan (jarum Ose) atau penyebaran (batang gelas) pada media agar  koloni tumbuh menyebar Penggoresan dilakukan berulang, sehingga Diperoleh kultur murni 1 sel  1 koloni

Cara Penggoresan Kultur pada Agar Cawan ; Goresan Langsung Goresan Kuadran Goresan Radian Goresan Kuadran http://www.personal.psu.edu/faculty/k/h/khb4/enve301/301labs/301labgraphics/streak.gif

Metode Penggoresan  Dengan penggoresan terjadi pengenceran sel secara gradien Goresan langsung Unt mengkultur mikroba) Goresan radian (unt mengkultur mikroba) Goresan Kuadran (isolasi koloni tunggal untuk mempelajari mikroba) http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-culture.html

Teknik Penyebaran (Spread-plate) Batang gelas http://www.studentsguide.in/microbiology/microbiology-tools-techniques/special-methods-of-isolation-of-pure-culture.html

Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & menggunakan peralatan yang sederhana Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/disebarkan pada media Dua sel dapat bergabung menjadi membentuk satu koloni Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak  pencegahan dengan menambahkan deterjen 2. Teknik Penuangan (Pour-plate) Prinsip : pengenceran contoh dengan media agar cair (+/- 450C) alam tabung reaksi, sehingga distribusi sampel merata  dituang ke petri dish & dibiarkan mengeras pada suhu ruang, lalu diinokulasi Tidak cocok untuk isolasi mikroba psikrofilik

Teknik Penuangan (Pour-plate) Sampel +/- 1 g) . . . . . . ... ….. 1 ml .... A A Agar cair Diperiksa . . . . . . B B Koloni terisolasi Pengenceran Suspensi Bakteri Penuangan Dibiarkan mengeras . . . . C C Inkubasi Tahap I Tahap II Tahap III Media agar miring

http://classes. midlandstech http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap06/lecture5.htm

Metode Penuangan  Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif (morfologi) & kuantitatif (jumlah sel mikroba) Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora  contoh terlebih dulu diberi perlakuan pemanasan s.d 850C selama 5 menit Media Selektif : - Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi Staphylococcus dari faeces - Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : Salmonellae Media Diferensial : - Media agar EMB (eosin-methylene blue agar)  terbentuk koloni berbeda & mudah dikenali E. coli : hijau kehitaman/hijau metalik Aerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda

Media cair dgn substrat khusus Contoh : bakteri tanah : α-conidendrin 3. Kultur Yang Diperkaya Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus (jumlah kecil & tumbuh lambat) Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu 1 2 3 4 Media cair dgn substrat khusus Contoh : bakteri tanah : α-conidendrin (-) (+) Verifikasi

4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution) Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam jumlah lebih besar dari pada mikroba lain. Contoh : S. lactis dalam susu asam Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 galur mikroba Perlu dicek kemurnian kultur

Serial-dilution Method http://dc338.4shared.com/doc/9lEZll1X/preview.html

5. Teknik Isolasi Sel Tunggal a. Metode Mikromanipulator Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari sampel Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet (tabung kapiler) di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal & dipindahkan ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media yang sesuai Lebih cepat, namun kelemahannya : - alat mahal - operator harus trampil

Micromanipulator http://eatingforaquadrillion.blogspot.com/2011/07/how-to-get-single-cell.html

Micromanipulator

b. Metode Kapiler untuk mendapatkan sel tunggal mikroba Beberapa tetes media yang mengandung mikroba, ditempatkan pada penutup gelas obyek steril menggunakan pipet kapiler steril. Dengan menggunakan mikroskop, cari tetesan yang mengandung hanya 1 mikroba. Tetesan tsb dipindahkan dengan pipet kapiler steril ke media segar  mikroba tunggal yang berada pada tetesan mulai berbiak untuk menghasilkan kultur murni.

Pembuktian Kemurnian Kultur Setelah diasumsikan berhasil mengisolasi kultur murni  perlu dilakukan pengujian dengan kriteria sbb. : (Kultur murni : sel-sel mikroba yang ada  sejenis) 1. Mikroba tampak mirip secara mikroskopis dan menunjukkan hasil pewarnaan yang sama 2. Pada saat ditanam pada agar cawan, semua koloni menunjukkan kesamaan . 3. Hasil penggoresan dll seragam 4. Beberapa koloni isolat mempunyai penampakan / karakteristik identik, contoh memfermentasi gula yang sama dll

SELEKSI & IDENTIFIKASI Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik  - rendemen lebih tinggi - tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak dikehendaki - peningkatan kemampuan penggunaan sumber C dan N yang murah  penurunan biaya prod. - Perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang lebih mudah dipisahkan dari produk Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba : 1. Mutasi 2. Rekombinasi

Taksonomi (klasifikasi) : penataan teratur unit-unit ke dalam kelompok satuan yang lebih besar  hierarkhi klasifikasi : spesies  genus  familia  orde  kelas  filum atau divisi Spesies : satuan atau kelompok dasar dalam semua sistem klasifikasi organisme Nomenklatur : penamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasi  binomial nomenklatur : menggunakan nama kombinasi biner Latin, misalnya Rhizopus oryzae Identifikasi : penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan nomenklatur untuk mengidentifikasi mikroba dengan membandingkan dengan ciri-ciri/ karakteristik yang ada a.l Menggunakan kunci-kunci identifikasi yang sesuai Contoh : Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

Contoh identifikasi bakteri : - tidak terdapat bakteroklorofil - sel tidak berbentuk filamen - Gram positif - berbentuk batang - menghasilkan endospora - Katalase positif - Aerobik - Nitrit negatif - VP (Voges Proskauer) negatif  Bacillus megaterium Identifikasi Kapang :  a.l. berdasarkan spora dan miselium Identifikasi khamir : a.l. berdasarkan spora & kemampuan memfermentasi gula sebagai sumber karbon

Setelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasi Metode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan ciri/karakteristik : 1. Morfologis Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak 2. Nutrisional Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba 3. Kultural Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media, baik cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna dll)

Contoh 1. Karakteristik Morfologis (Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidak) Aspergillus E. coli Streptomyces Penicillium

Sel Bakteri Contoh 1. Bentuk & Susunan Sel http://content.answers.com/main/content/img/elsevier/dental/f0396-02.jpg

Contoh 3. Karakteristik Kultural  Tampilan pertumbuhan pada media padat (bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)

Kultur pada Agar Miring

4. Metabolik Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba ( contoh kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll) Contoh : E. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan Salmonella typhi tidak dapat 5. Susunan Kimiawi Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, nukleus, membran dll) 6. Susunan Antigen Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khas * Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saat diinjeksikan ke hewan 7. Patogenik Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit 8. Genetik Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe

PEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNI Tujuan : menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan genetik & tidak terkontaminasi  harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba selama diawetkan Cara : 1. Pemindahan Secara Periodik - Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar, contoh : media agar miring - Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus tepat dan disimpan pada suhu dingin (50C)  tidak cocok untuk penyimpanan jangka panjang  bakteri 2-3 minggu, fungi 3-4 minggu

2. Pelapisan Kultur dgn Minyak Mineral - Permukaan agar miring atau media cair dilapisi dengan minyak mineral steril (parafin) +/- 0,5 inci - Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah permukaan minyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dengan tetap mempertahankan kultur awal - Lapisan parafin menjadikan kondisi anaerob dan mencegah pengeringan medium mikroba dorman  pengawetan dapat beberapa tahun

3. Liofilisasi  Pengeringan beku (freeze-drying) - Sel mikroba dikering-bekukan & aktivitas metabolisme stop (dorman)  efektif untuk bakteri (dapat tetap hidup & tidak berubah selama bertahun-tahun - Cara : * media berisi senyawa pelindung/penstabil : susu, serum, natrium glutamat dll * suspensi mikroba (±0,2 ml) ditempatkan dalam ampul (vial) kaca * Perendalam dalam es kering + alkohol (-780C)  beku * Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum  kering (sublimasi) * Ampul ditutup dengan melelehkan ampul kaca tsb dlm keadaan vakum  penyimpanan pada suhu 40 C - Keuntungan : Cocok untuk penyimpanan jangka panjang, (tahunan) & kemungkinan perubahan kecil & Wadah penyimpanan kecil

Freeze drying Chamber Sampel Kondensor Pompa vakum Foto Alat Freeze Dryer

4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah (Cryopreservation) - Menggunakan nitrogen cair (sekitar -156 sampai-1960C) - Sel dibekukan dengan diberi bahan pelindung beku (gliserol atau dimetil sulfoksida)  mencegah pembentukkan kristal es & meningkatkan ketahanan hidup sel mikroba - Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair - Cocok untuk kapang - Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini

5. Penyimpanan pada Tanah Steril - Diterapkan untuk penyimpanan spora bakteri, actinomycetes dan kapang - Suspensi 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 g bubuk tanah steril (campuran pasir halus dan tanah liat 1:1) - Dibiarkan pada suhu kamar selama 10 hari sampai kering  disimpan pada lemari es

PEMANTAUAN VIABILITAS DAN KESTABILAN MIKROBA Sebelum dan sesudah penyimpanan, sebaiknya viabilitas mikroba diperiksa, sehingga mikroba yang mati selama penyimpanan dapat diketahui Sebaiknya diperiksa pula morfologi dan karakteristik biokimianya

THE RIBOSOMAL 16S GENE AND BACTERIAL IDENTIFICATION AND CLASSIFICATION The most powerful techniques for bacterial identification are based on comparisons of an essential gene, the ribosomal 16S gene. This gene codes for the RNA present in the small subunit of the ribosome. Ribosomes are the machinery that translates DNA sequence into proteins using the universal genetic code. Because fidelity and maintenance of this translation function are critical, some regions of the rDNA are so highly conserved that they can be used to align genes from dissimilar organisms.

Other regions less critical to translation of the code are under less selective pressure and show enough variation so that each species has a unique sequence. This variation allows similar species to be distinguished. Currently over 125,000 bacterial 16S sequences have been deposited in the major public DNA databases, GenBank and the Ribosomal Database Project. An unknown bacterium can be identified by obtaining its 16S gene DNA sequence and comparing it to sequences in these databases with a search engine called BLAST. The process is commonly referred to as “BLASTing.”

QUIZ Optimasi media kultivasi merupakan tahap penting dalam pengembangan proses produksi yang ekonomis. Di samping kelebihan-kelebihan yang dimiliki kultivasi, harga juga harus dapat berkompetisi dengan sintesis secara kimia. Usaha-usaha apa yang dapat dilakukan untuk menekan biaya media kultivasi ? Menurut sdr hasil samping atau limbah agroindustri apa di daerah sdr yang berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku pembuatan bioproduk ? Produk apa yang prospektif dihasilkan dari hasil samping/ limbah tsb ?