KROMATOGRAFI

“CHROMATOGRAPHY” DIKENALKAN OLEH TSWETT (1906) “CHROMA” ATAU“COLOR” DAN “ GRAPHEIN” ATAU “WRITE” PEMISAHAN KLOROFIL DAN PIGMEN DARI TANAMAN MENGGUNAKAN TABUNG ( KOLOM) YG DIISI PADATAN KALSIUM KARBONAT DAN DIELUSI DENGAN PELARUT ORGANIK  TERJADI PEMISAHAN YG BERUPA PITA PITA YG BERWARNA PADA KOLOM FASE DIAM BERUPA PADATAN BERPORI YG DIGUNAKAN SENDIRIAN ATAU DILAPISI DGN FASE DIAM ZAT CAIR ( DISEBUT DGN PADATAN PENDUKUNG) FASE GERAK DISEBUT ELUEN ATAU PEMBAWA PROSES DIMANA ELUEN BERGERAK DGN MEMBAWA KOMPONEN DISEPANJANG KOLOM DISEBUT ELUSI

“I call such a preparation a chromatogram and the corresponding method the chromatographic method.” — M.S. Tswett Mikhail Semenovich Tswett

as one obtained by traditional means. In Tswett’s opinion, a scientist always must consider the whole sample and separate all the substances present. He also emphasized that a chromatographically separated substance is at least as pure as one obtained by traditional means.

Teknik pemisahan komponen dalam campuran dimana analit terdistribusi dalam fasa gerak (mobile phase) dan fasa diam (stationary phase) Prinsip pemisahan berdasarkan perbedaan distribusi analit antara fasa diam dan fasa gerak menghasilkan perbedaan kecepatan migrasi Dasar kromatografi: mengubah sistem kesetimbangan statis menjadi dinamis antara fase diam dan fase gerak Bisa digunakan untuk analisis kualitatif, kuantitatif, dan preparatif Kromatografi

KROMATOGRAFI BERDASARKAN ASAS TERJADINYA PROSES PEMISAHAN : ADSORPSI (FASE DIAM : PADAT & FASE GERAK : CAIR / GAS) pemisahan tergantung perbedaan polaritas molekul Kromatografi kolom konvensional Kromatografi penukar Ion Kromatografi gas padat Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) PARTISI (FASE DIAM: CAIR & FASE GERAK : CAIR) pemisahan tergantung perbedaan koefisien distribusi. Kromatografi kolom Kromatografi kertas Kromatografi lapis tipis Kromatografi gas cair Kromatografi cair kinerja tinggi

3. FILTRASI (FASE DIAM: PADAT & FASE GERAK : CAIR) pemisahan tergantung perbedaan struktur dan ukuran molekul 4. SUHU KRITIK (PENGEMBANGAN KROMATOGRAFI GAS DAN HPLC & FASE GERAK : CO2 SUPERKRITIK ), Sistem kesetimbangan dalam kromatografi lebih ditekankan pada sistem kesetimbangan partisi( sifatnya ideal) dari pada adsorpsi (sifatnya non ideal)

Tipe Kromatografi Berdasarkan FG dan FD GAS-CAIR KROMATOGRAFI GAS GAS-PADAT a CAIR-CAIR KROMATOGRAFI CAIR b CAIR-PADAT a Kromatografi kertas Kromatografi lapis tipis b Kromatografi penukar ion

Kategori interaksi 1. Adsorbsi Senyawa diserap oleh permukaan padatan dan terjadi keseimbangan jumlah solut pada fasa diam dan fasa gerak 2. Partisi Lapisan cairan sebagai fasa diam yang diembankan pada suatu padatan akan mendistribusi senyawa yang akan dipisahkan dan membentuk keseimbangan dengan fasa gerak 3. Molekular eksklusi/permeasi gel/gel filtrasi Pemisahan berdasarkan ukuran molekul, dimana pada keadaan ideal tidak ada keterikatan senyawa pada fasa diam 4. Penukaran ion Senyawa ion dengan muatan berlawanan akan terikat pada fasa diam melalui gaya elektrostatik 5. Afinitas Adanya interaksi yang spesifik antara molekul jenis tertentu dengan molekul lain yang terikat secara kovalen pada fasa diam

Adsorption Chromatography Adsorption chromatography is probably one of the oldest types of chromatography around. It utilizes a mobile liquid or gaseous phase that is adsorbed onto the surface of a stationary solid phase. The equilibriation between the mobile and stationary phase accounts for the separation of different solutes.

Partition Chromatography This form of chromatography is based on a thin film formed on the surface of a solid support by a liquid stationary phase. Solute equilibriates between the mobile phase and the stationary liquid.

Ion Exchange Chromatography In this type of chromatography, the use of a resin (the stationary solid phase) is used to covalently attach anions or cations onto it. Solute ions of the opposite charge in the mobile liquid phase are attracted to the resin by electrostatic forces.

KROMT METODE PEMISAHAN F. GERAK F. DIAM TYPE KESETM GSC/KGP GLC/KGC GBPC LLC LSC LBC IEC GPC PC TLC SFC GAS – PADAT GAS – CAIR GAS – BONDED PHASE CAIR – CAIR CAIR – PADAT CAIR – BONDED PHASE PERTUKARAN ION PERMIASI GEL CAIR- CAIR CAIR-PADAT GAS/ CAIR CAIR GAS CAIR GAS/CAIR (CO2 SC) PADAT F.ORG TERIKAT F. ORG TERIKAT RESIN Z. PDT POLIMER ABSORPSI PARTISI ADSORPSI / PARTISI ADSORPSI ADSORPSI/PARTISI PENYARINGAN

KROMATOGRAFI ELUSI Pada dasarnya hampir semua proses kromatografi adalah elusi Dalam kolom kromt elusi, zat yang dipisahkan tergantung pada perbedaan partisi / distribusi antara fase diam (terpacking dalam kolom ) dan fase gerak (mengalir melalui kolom)

JIKA DALAM SAMPEL TERDAPAT ZAT A DAN B YANG AKAN DIPISAHKAN , MAKA SAAT KEDUANYA BERGERAK KEBAWAH SEPANJANG KOLOM, KECEPATANNYA TERGANTUNG PADA RATIO DISTRIBUSI (DC ATAU m ) Dalam kromatografi ratio distribusi lebih sering disebut dengan ratio kapasitas atau faktor kapasitas (k )

Jika harga k kecil, maka komponen / analit akan bergerak dalam kolom lebih cepat . Bila komponen A dan B mempunyai harga k yang berbeda cukup besar, maka akan terjadi pemisahan.

tm, to = Waktu migrasi , tr = waktu retensi , h = tinggi puncak tw, W = lebar puncak , random fluctuations longitudinal diffusion (negligible in liquids) eddy diffusion or “channeling”

PENGARUH KECEPATAN MIGRASI RELATIF DAN PELEBARAN PITA PADA RESOLUSI KONSENTRASI B A B A JARAK MIGRASI Beberapa variabel kimia dan fisika dapat mempengaruhi Kecepatan pada pemisahan pita/puncak dan lebar pita agar Didapat pemisahan yg sempurna : Menambah kecepatan pada pita pemisahan Mengurangi kecepatan dari luas/lebar pita Alternatif tsb dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

KROMATOGRAM MULA MULA DENGAN PUNCAK YG OVERLAP DIPERBAIKI DENGAN MENAMBAH KECEPATAN PITA PEMISAHAN SIGNAL DETEKTOR B DIPERBAIKI DENGAN MENGURANGI KECEPATAN DARI LUAS PITA C W A K T U

KECEPATAN MIGRASI ZAT TERLARUT Kurang efektifnya kolom kromatografi dalam memisahkan komponen tergantung pada kecepatan relatif dari komponen/analit yg dielusi, ditentukan oleh perbandingan partisi komponen/analit diantara 2 fase. Perbandingan partisi Distribusi analit diantara fase diam dan fase gerak digambarkan cukup sederhana. Analat berada dalam kesetimbangan diantara dua fase A (fase gerak) a (fase diam) Konstanta kesetimbangan (k) koefisien partisi didefinisikan sebagai konsentrasi molar analati dalam fase diam dibagi dengan konsentrasi molar analat dalam fase gerak.

Jika K bertambah besar, maka komponen akan lebih lama melewati kolom (1) Harga K idealnya konstan, tidak tergantung pada konsentrasi, tetapi dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti temperatur. Jika K bertambah besar, maka komponen akan lebih lama melewati kolom Untuk pemisahan diasumsikan bahwa: Kolom panjangnya tetap dan alirannya konstan

2. Waktu retensi (tR) Adalah waktu yang diperlukan diantara injeksi sampel dan munculnya puncak / pita komponen pada detektor dari kolom kromatografi Volume retensi (VR) adalah volume yang diperlukan oleh fase gerak untuk mengelusi komponen sampai maksimum dari kolom Tiap komponen dalam sampel punya tR yang berbeda beda. Waktu yang diberikan untuk fase gerak atau komponen yang tidak tertahan melewati kolom disebut waktu migrasi / waktu mati ,tM atau to

/ VR /t0 Dimana VR = tR x kec. alir Puncak kecil sebelah kiri menggambarkan komponen yang tidak tertahan oleh fase diam pada kolom dan mencapai detektor hampir langsung setelah elusi dimulai. Waktu migrasi / waktu mati melengkapi pengukuran dari kecepatan migrasi rata rata dari fase gerak. tM sangat penting dalam identifikasi puncak komponen/ analat.

Cara praktis untuk meningkatkan efisiensi kolom: Padatan pendukung harus terbuat dari partikel partikel yang kecil, ukurannya sama, biasanya dari tanah diatome yg mempunyai ukuran mesh 100 -200. Kecepatan aliran gas pembawa adalah optimum pada H minimum Gas pembawa dgn BM besar biasanya N2 akan tetapi dapat juga He atau H2 Fase diam yg digunakan harus mempunyai viskos yang rendah Banyaknya/jumlah fase diam yg dipakai biasanya 1 – 10% dari berat padatan pendukung

Dalam kromatografi (GLC), bentuk kromatogram yang bagus adalah berupa garis tegak. Garis yang tipis merupakan pemisahan yang sempurna, tapi keadaan ideal ini sulit tercapai Bentuk kromatogram yg sering muncul adalah kurva melebar (kurva gauss) atau puncak yang mengekor atau pemanjangan dimuka. B C A D injeksi

Jenis kromatografi Kromatografi kertas Kromatografi kolom Kromatografi lapis tipis (KLT) Kromatografi gas (GC) kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

Keuntungan Metode pemisahan yang cepat dan mudah Menggunakan peralatan yang sederhana dan murah Volume cuplikan/sampel yang sedikit Bisa dilakukan replikasi/pengulangan Keuntungan