Rekayasa Enzim dan Metagenom

Presentasi berjudul: "Rekayasa Enzim dan Metagenom"— Transcript presentasi:

1 Rekayasa Enzim dan Metagenom

2 Keanekaragaman Protein
Keanekaragaman hayati Rekayasa Protein

3

4 Pembuatan Mutan Directed Random Recombination

5 Rational Protein Design
Perubahan asam amino/urutan spesifik Ideal: perubahan sifat yang dapat diprediksi Memerlukan informasi struktur protein dan ‘intuisi’

6 Efficient & Rational Protein Design
Interdisiplin Gen berada dalam vektor ekspresi yang baik Struktur 3-D protein Computer modelling Struktur 3-D protein homolog, jika tidak ada informasi struktur Informasi struktur-fungsi dari protein homolog/related

7 Directed rational (site directed mutagenesis) G
TAC GGC CCG TAA A C CGC ATC TTT AAA AAA AAT ATG CCC GGC ATT TTG GCG TAG AAA TTT TTT TTA

8

9 Perbaikan Stabilitas Protein
Penambahan ikatan disulfida: Lokasi sistein berdekatan pada struktur 3 D Bukan merupakan pusat aktif Tidak merubah struktur Mengganti asam amino yang dapat teroksidasi asparagin dan glutamin. Penambahan ikatan hidrogen, jembatan garam, interaksi hidrofobik

10

11

12 Varian Streptokinase WT Lys386Gln Lys59Gln Lys386Gln, Lys59Gln Mutasi menyebabkan protein menjadi tahan terhadap plasmid

13 Random: Error prone PCR
Kesalahan pada saat polimerisasi oleh DNA polimerase Penurunan fidelitas DNA polimerase oleh ion Mn2+ Penurunan konsentrasi nukleotida Peningkatan siklus PCR Terbatas pada fragmen berukuran kecil ( <800pb)

14 Recombination: DNA shuffling
Stemmer WP. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature , Pencampuran materi genetik dari induk yang berbeda DNA induk dipotong dengan DNaseI Fragmen acak mengalami proses denaturasi, annealing, dan perpanjangan yang dikatalisis oleh DNA polimerase

15

16 Recombination Family shuffling
Extention of technique to homologous genes Need >60% similarity 1. Fragment 2. Reassemble

17 DNA Shuffling

18

19 Recombination DNA shuffling
Wt gene Error prone PCR or other method DNase I fragmentation

20

21

22

23 α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens
Temperatur optimum 50oC-70oC pH optimum 6 Likuifasi pati dan detergen Site directed mutagenesis: BAA S201N (pada pH 10 aktivitas meningkat 16%; pada pH 10 aktivitas meningkat 50%) dan BAA N297D (pada pH 10 aktivitas sama dengan WT; pada pH 11 aktivitas meningkat 50%) Error prone PCR: 7200 klon – 16 mutant DNA shuffling: klon: 960 klon positif berdasarkan uji staining. Penapisan ulang: BAA42 (pH optimum 7, aktif pada daerah pH yang lebih luas, aktivitas meningkat 5 x pada pH 10) dan BAA 29 (profil pH sama dengan WT, aktivitas spesifik meningkat 9 x)

24 Lili Euwilaichtr

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44