Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

BIOASSAY GUIDED FRACTINATION DR. WARSINAH, M.SI., APT JURUSAN FARMASI FKIK.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "BIOASSAY GUIDED FRACTINATION DR. WARSINAH, M.SI., APT JURUSAN FARMASI FKIK."— Transcript presentasi:

1 BIOASSAY GUIDED FRACTINATION DR. WARSINAH, M.SI., APT JURUSAN FARMASI FKIK

2 BIOASSAY GUIDED FRACTINATION PEMISAHAN (FRAKSINASI) UJI AKTIVITAS

3 EKSTRAKSI Tanaman basah -Senyawa target td rusak karena panas -Mudah -Contoh: Enfloret.perendaman tanaman dengan minyak untuk diambil minyakya) Pengambilan minyak kemiri (dipres) Tanaman basah -Senyawa target td rusak karena panas -Mudah -Contoh: Enfloret.perendaman tanaman dengan minyak untuk diambil minyakya) Pengambilan minyak kemiri (dipres) Simplesia (tanaman kering) -Maserasi (direndam dengan pelart dalam watu tertentu) -Decocta (direndam pakai air panas) -Perkolasi (dialiri pelarut dan ekstrak ditamung) -Sohxletasi (dialiri pelarut yang dipanaskan terlebih dulu dan ekstrak ditampung pada labu tempat pelarut dipanaskan

4 Enfloret Tempat pemanas MINYAK kelapa pemanas Bahan

5 MASERASI DIKERINGKAN DAN DISERBUK ditimbang 1/3 2/3

6 DECOCTA AIR PANAS (MENDIDIH) 24 JAM

7 perkolasi

8 SOHXLETASI Tabung atas: pendingin spiral/liebig Tabung bawah: sampel Labu alas bulat: tempat pearut dan ekstrak Air masuk

9 fraksinasi 1.Cair –cair> dengan corong pisah 2.Padat cair > perendaman > kromatografi kolom > Kromatografi lapis Tipis > kromatografi kertas > HPLC (High Performan liquid chromatografi )

10 Cair- cair (corong pisah ) -Pelarut yang digunakan tidak dapat campur dengan pelarut yang digunakan untuk mengekstrak -contoh: pelarut utk mengekstrak etanol senyawa yang akan diambil asam lemak maka pelarut yang digunakan adalah pelarut non polar seperti n-heksan, kloroform, ether atau dietylether

11 Kromatografi lapis tipis UV 254 UV 366

12 Kromatografi kolom Tinggi tabung : 60 cm Tinggi silika: 2/3 tabung Garis tengah Tabung: 8,6,4,2 & 1 cm Pelarut: tunggal atau campuran ( non polar ke polar)

13 HASIL FRAKSI

14 UJI AKTIFITAS 1.ANTI OKSIDAN : BHT ATAU DPPH 2.ANTIINFLAMSI: OEDEN KAKI TIKUS 3.ANTIBAKTERI: BAKTERI GRAM POSITIF ATAU GRAM NEGATIF 4.ANTIJAMUR : JAMUR CANDIDA ALBICAN 5.ASAM URAT: ASAM OSOLONAT 6.ANTIKANKER: INVITRO- SEL, INVITRO: TIKUS 7.ANTIDIABETUS MELITUS : TIKUS 8.ANTI ASMA: OTOT POLOS USUS SAPI

15 Contoh bioassay guided fraktnation simplisia serbuk Diseleksi Dikeringkan Ditumbuk Maserasi dengan metanol(3x24 jam) Saring dan diuapkan Ekstrak metnol Pembuatan simplesia dan ekstrak Kulit batang B gymnorhiza

16 2. Fraksinasi fraksi metanol Fraksi metanol Fraksinasi degan n-heksan Fraksi larut n heksan residu Fraksinasi dengan kloroform Fraksi larut kloroform residu Fraksinasi dengan Etilasetat Fraksi larut etil asetat residu Larut metanol Uapkan Uji aktifitas

17 CARA KERJA 1. FRAKSINASI fraki kloroform DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM F1 F2F3F4 Fraksi kloroform

18 2. Pembuatan larutan uji Fraksi aktif dilarutkan 1,25% DMSO Kadar 1 Kadar 2 Stoksampel 10 ug/ml kadar 3 saring ditimbang kadar 4 kadar 5 18

19 3. Uji sitotoksik/ antiprolferatif Selsampel Sel + sampel Media+ sel Sel+ doksorubisin INKUBASI 24 jam Media Dokso rubisin MTT INKUBASI 4 JAM, 37C REAGEN STOPER INKUBASI SEMALAM Absorban Elisa reader Media+ sampel 19

20 A. Ekstrak Metanol Kulit Batang B. gymnorhiza dan Aktivitas Sitotoksiknya Rendemen ekstrak metanol : 13,07%). ekstraksi pada tanaman Rhizopra mucronata menghasilkan ekstrak sebesar 9,71% (Diastuti, 2009), tanaman Avicinea oficinale sebesar 9,25% (Bayu, 2009) dan Ipomea pescaprae sebesar 7,58% (Handayani, 2008 IC 50 sebesar 228,78 µg/ml Contoh hasil uji aktifitas

21 Gambar 5. Efek ekstrak metanol terhadap perubahan morfologi sel HeLa. Pengamatan morfologi sel pada jam ke 24 dilakukan dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 200x : kontrol sel (a), kontrol DMSO (b), perlakuan ekstrak metanol 500 µg/ml (c), 250 µg/ml (d) 125 µg/ml (e) dan 62,5 µg/ml (f), menunjukkan sel mati, mengapung, keruh, dan berbentuk bulat, menunjukkan sel hidup melekat didasar dan berbentuk daun Morfologi sel HeLa

22 B. Fraksinasi Ekstrak Metanol dan Aktivitas Sitotoksik FraksiWarnaBerat fraksi (gr)% rendemen n-heksanKuning4,72,35 KloroformMerah ungu38,619,30 etilasetatKuning muda3,21,60 ResiduCoklat merah153,576,75 Hasil partisi ekstrak metanol dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etil asetat

23 Aktivitas sitotoksik Efek fraksi n-heksan, kloroform, etil asetat dan residu terhadap viabilitas sel kanker HeLa dengan metode MTT Harga IC50 fraksi F1-F5

24 C. Fraksinasi Fraksi Kloroform dengan Kromatografi Cair Vakum Hasil Fraksinasi Fraksi Kloroform dengan Kromatografi Cair Vakum Fraksi Gabungan Eluat no Warna fraksi Berat fraksi (gr) F1F2F3F4F5F1F2F3F4F Putih Ungu kemerahan Kuning Coklat tua 1,9 2,7 1,4 0,9 21,4

25 Profil komatogram KLT fraksi F 1 -F 5. Fase diam silika Gel 60 GF 254 dengan fase gerak kloroform : etil asetat (6:4) dan dideteksi dibawah sinar UV 254 Rf 0,52 Coklat Rf 0.51

26 Kurva efek perlakuan fraksi F 1 - F 5 terhadap viabilitas sel HeLa. Sel kemudian diberi perlakuan fraksi F1- F5 dengan konsentrasi 500, 250, 125 dan 62,5 dan 31,25 µg/ml dan diinkubasi selama 24 jam. Profil viabilitas sel disajikan dari rata-rata ± Standart deviasi (SD) dari 3 perlakuan. Harga IC50 fraksi F1-F5 Uji aktivitas sitotoksik

27 D. Fraksinasi Fraksi F 2 dan Aktivitas Sitotoksik Fraksi gabungan No eluatWarna fraksi Berat fraksi (mg) S1S1 1-4Kuning54 S2S2 5-16Putih19,6 S3S Ungu158 S4S Putih19,3 S5S Kuning muda224 S6S Hijau54 S7S Coklat67 S8S Coklat87 S9S Coklat480 Hasil pemisahan fraksi F2

28 Profil kromatogram KLT fraksi gabungan (S1-S9), dibawah UV 254 (a) dan UV 366 (b)

29 Efek fraksi S 1 - S 9 terhadap viabilitas sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan 100, 50, 25, 12,5 dan 6,25 µg/ml. Profil viabilitas sel menunjukkan dose dependent Efek sitotoksik fraksi S1-S9 terhadap sel Hela dan Harga IC50 Harga IC 50 pada perlakuan fraksi S 1- S 9 terhadap sel HeLa

30 E. Fraksinasi Fraksi S3 dan Aktivitas Sitotoksik Fraksi gabunganNo eluatWarna fraksiBerat fraksi (mg) T1T1 1-4Kuning12 T2T2 5-16Kuning19 T3T Kuning18 T4T Ungu48 T5T Kuning muda18 T6T Hijau13 T7T Coklat15 T8T Coklat18 T9T Coklat48 Fraksi gabungan dari hasil pemisahan fraksi S 3

31 Profil kromatogram KLT fraksi gabungan T 1 - T 9 dibawah UV 254 ungu coklat

32 Efek sitotoksik fraksi gabungan T 1 - T 9 terhadap viabilitas sel HeLa Nilai IC 50 dalam µg/ml fraksi gabungan T 1 -T 9 pada sel HeLa

33 F. Fraksinasi Fraksi T4 dan Aktivitas Sitotoksik Fraks i No eluat Warna fraksiBerat fraksi (mg) I1I1 1-3Kuning1,9 I2I2 4-7Ungu32 I3I3 8-9Merah2,34 1. Hasil pemisahan T4 2. Profil KLT I1, I2, dan I3 ungu NoNama isolate Harga IC 50 (µg/ml) 1Isolat 1 (I 1 )11,66 2Isolat 2 (I 2 )4.72 3Isolat 3 (I 3 )24,72 3. Aktivitas sitotoksik dilihat dari harga IC50

34 Efek isolat terhadap viabilitas sel Hela Efek isolat I 1 Efek isolat I 2 Efek isolat I 3

35 G. Pemurnian Fraksi I 2 IsolatWarna isolatBerat isolat (mg) Isolat 1Kuning2, 7 Isolat 2Merah1,4 Isolat 3Ungu29 Hasil pemurnian fraksi I 2 menggunakan fase diam sephadex LH 20 dan fase gerak metanol Uji kemurnian dengan KLT Kromatogram KLT isolat aktif yang telah dimurnikan. (a) fase gerak kloroform:etilasetat (6:4), (b) fase gerak n-heksan: etilasetat (3:7), (c) fase gerak n heksan: metanol (5:5) NoFase gerakHarga Rf 1kloroform:etilasetat (6:4)0.69 2n-heksan: etilasetat (3:7)0,59 3n heksan: metanol (5:5)0,35 Harga Rf isolat aktif pada fase diam silika gel GF254 dengan tiga fase gerak yang berbeda polaritasnya

36 H. Aktivitas Biologis Isolat Aktif Efek isolat aktif terhadap viabilitas sel HeLa. Konsentrasi yang digunakan 10, 5, 2.5, 1.25 dan 0.63 µg/ml 1. Efek sitotoksik IC 50 = 4,13 µg/ml

37 Efek antiproliferatif isolat pada berbagai konsentrasi terhadap sel HeLa pada berbagai waktu. 2. Efek antiproliferatif isolat aktif terhadap sel HeLa - Inkubasi 3x10 3 sel HeLa selama 24 jam. -Waktu penamatan 0, 24, 28 dan 72 jam -Konsentrasi isolat maupun doxorubibicin uang dignakan 1, 2 dan 4 µg/ml)

38 3. Pengaruh isolat terhadap siklus sel Pengamatan siklus sel HeLa dengan flow cytometri setelah inkubasi 24 jam PerlakuanM5M1M2M3M4 subG1G1SG 2 -MHiperploidi Kontrol4,5856,1212,8114, Doxorubicin , ,67 Isolat ,1024, Hasil analisis siklus sel HeLa dengan perlakuan isolat (2 µg/ml) dan doxorubicin (2 µg/ml) pada pengamatan 24 jam dibanding sel kontrol

39 4. Aktivitas Isolat pada Induksi Apoptosis sel HeLa a. Metode double staining Hasil pengamatan morfologi sel Hela dengan pengecatan DNA menggunakan akridine orange – etidium bromide Sel hidup berwarna hijau terang berbentuk daun sel Hela terlihat berwarna orange dengan bentuk yang tidak teratur yang mengindikasikan sel mengalami apoptosis kontrolPerlakuan isolat aktif

40 b. Induksi apoptosis dengan metode Flowcytometri Pengamatan induksi apoptosis sel HeLa menggunakan metode Flowcytometri. Kontrol (A), perlakuan doxorubicin 2 µg/mL (B) dan perlakuan isolat aktif 2,16 µg/mL (C). (Sh) sel hidup, (an) sel mati nekrosis, (ap) sel mati secara apoptosis Jenis sampel% hidup% apoptosis % nekrosis Kontrol61,5717, 9018,02 Doxorubicin1, ,77 Isolat46,7723,2618,59 Hasil analisis induksi apoptosis dengan Flowcytometri

41 5. Pengamatan ekspresi protein a. Ekspresi P53 Kontrol selPerlakuan doxorubicin Perlakuan isolat Efek perlakuan isolat aktif terhadap ekspresi p53 pada sel HeLa. Sel Hela ditanam sebanyak 5x10 4 sel/sumuran pada coverslips dalam plate 24. Selanjutnya diberi perlakuan isolat aktif maupun doxorubicin.


Download ppt "BIOASSAY GUIDED FRACTINATION DR. WARSINAH, M.SI., APT JURUSAN FARMASI FKIK."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google