PENYIMPANAN DAN PEMELIHARAAN KULTUR PRINSIP TEKNIK FERMENTASI PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

PEMELIHARAAN KULTUR STOK Upaya mendapatkan kultur yang aktif Transter periodik atau subkultur metode tradisional untuk memelihara isolat. Tidak direkomendasikan utk pemeliharaan jangka panjang Kemungkinan kontaminasi dan salah memberi label Teknik 2 kultur (kultur stok pertama dan kedua)  backup Kultur stok pertama untuk menyiapkan kultur yang baru Kultur stok kedua sbg kultur kerja untuk inokulasi rutin Periode subkultur tergantung dari jenis mikrobanya Haemophilus  sehari atau dua hari E. coli, S. aureus  orde bulan Ketahanan kultur dipengaruhi oleh sifat organisme, komposisi dan pH medium, tingkat aerasi dan hidrasi, dan suhu penyimpanan Variasi teknik: dilapisi oleh parafin steril

PENYIMPANAN KULTUR Kultur mikroba rentan terhadap : Kontaminasi Mutasi spontan Deteriorasi Kematian Pemilihan metode penyimpanan dipengaruhi oleh: Tingkat viabilitas yang diperlukan Perubahan genetik yang mungkin terjadi Jumlah isolat yang memerlukan penyimpanan Lamanya penyimpanan kultur Biaya

TEKNIK PENYIMPANAN KULTUR Penyimpanan dengan pertumbuhan kontinu Teknik yang memungkinkan mikroba tetap tumbuh dan melakukan metabolisme selama penyimpanan.  Manipulasi kondisi pertumbuhan: pembatasan sumber karbon, nitrogen, energi, penurunan suhu, pencegahan dehidrasi Dehidrasi atau pengeringan  pengeringan dg udara, desikasi, pengeringan dg vakum baik dari fase cair maupun beku Penyimpanan beku atau kriopreservasi Penyimpanan pada suhu rendah sehingga mikroba membeku untuk mereduksi atau mencegah seluruh metabolisme dan perubahan fisik

PENYIMPANAN DENGAN PERTUMBUHAN KONTINU 1. Penyimpanan di bawah lapisan parafin Dapat digunakan untuk menyimpan bakteri dan jamur Menghambat pertumbuhan dengan cara mereduksi: ketersediaan oksigen dehidrasi dengan mencegah evaporasi medium dan mikroba Bakteri dapat bertahan 2 – 4 tahun Jamur dapat bertahan lebih lama (s/d 40 th), tetapi disarankan dilakukan re-preservasi antara 2 – 10 th. Tidak disarankan untuk penyimpanan jangka panjang karena variasi genetik mudah terjadi. 2. Penyimpanan dalam air Teknik ini memungkinkan sedikit pertumbuhan, tetapi dapat dimodifikasi untuk mereduksi pertumbuhan sehingga hampir tetap. Metabolisme masih mungkin terjadi, sehingga sel akan terdeteriorasi dan mati apabila terlambat dipindahkan Sebelum disimpan kultur harus ditumbuhkan sampai terjadi sporulasi atau mencapai fase akhir logaritma.

Protokol 1. Penyimpanan pada agar di bawah lapisan minyak A. Inokulasi dan penyimpanan Inokulasi medium pertumbuhan dengan strain yang akan dipelihara / disimpan Beri label kultur, satu sbg kultur stok penyimpanan, dan satu sebagai stok kerja Inkubasi pada suhu pertumbuhan optimum sampai mencapai fase akhir logaritma atau telah berspora Tambahkan 8 – 10 mL parafin cair (kualitas medis, specific gravity 0,83 – 0,89, diautoklaf 121oC, 20 menit selama 2 hari berturut-turut) sampai menutupi seluruh agar miring Kultur disimpan pada suhu 15-20oC B. Recovery Ambil sebagian kultur stok kerja dengan ose steril Hilangkan minyak sebanyak mungkin dari inokulum Inokulasikan ke dalam medium segar ( sebaiknya dalam agar miring agar sisa minyak dapat terkumpul di bawah, dan mikroba dapat tumbuh pada bagian yang tidak berminyak) Kultur stok simpanan hanya digunakan bila kultur stok kerja terkontaminasi atau waktu kadaluarsa penyimpanan sudah tercapai

Protokol 2. Penyimpanan jamur di dalam air A. Penyimpanan Potong blok agar yang telah ditumbuhi koloni jamur sebanyak 6 mm3, umumnya dari ujung pertumbuhan Pindahkan 20-30 blok agar ke dalam dua atau lebih botol Universal 30 mL yang berisi 10 mL air destilasi steril Beri label kultur, satu sbg kultur stok penyimpanan, dan satu sbg stok kerja. Tutup botol Universal (“screw cap”) dan simpan pada suhu 20 – 25oC B. Recovery Pindahkan blok agar dari stok kerja dan simpan mikroba terbalik menghadap medium pertumbuhan yang sesuai Inkubasi pada kondisi pertumbuhan yang sesuai Kultur stok simpanan hanya digunakan bila diperlukan re-preservasi C. Catatan: Protokol direkomendasikan untuk jamur, terutama fungi fitopatogenik, untuk penyimpanan 2 – 7 th. Metode modifikasi, sel dan spora dipanen dan disimpan dalam air, sesuai untuk jamur, ragi, bakteri patogen tanaman, dan aktinomiset

PENYIMPANAN DENGAN TEKNIK DEHIDRASI Pengeringan dalam desikator atau medium pendukung Penghilangan air dari sistem biologis akan mereduksi terjadinya reaksi kimia atau biokimia  mereduksi perubahan variasi atau deteriorasi Contoh media pendukung atau desikan: Tanah, pasir atau gel silika  jamur Gel silika atau manik porselen  jamur dan bakteri Kertas Whatman atau gel silika  ragi Modifikasi teknik: menggunakan medium pensuspensi seperti 10% susu skim dan 3% inositol atau 5% madu Jamur dapat bertahan 20 th, tetapi direkomendasikan untuk melakukan re-preservasi setelah 8 th

PENYIMPANAN DENGAN TEKNIK DEHIDRASI (Lanjutan…) L-drying Metode pengeringan vakum tanpa pembekuan, sesuai untuk bakteri, terutama yang sensitif terhadap tahap awal pembekuan pada “freeze-drying” Freeze drying Metode dehidrasi vakum dengan sublimasi es pada tekanan rendah Kandungan air sisa harus sekitar 2% untuk menjaga viabilitas sel, kandungan air yang terlalu tinggi dapat mempersingkat periode “survival” Sesuai untuk bakteri, jamur berspora, dan ragi, tetapi tidak sesuai untuk mikroalga eukariot

Protokol 3 Penyimpanan dalam gel silika A. Penyimpanan Isi 1/3 botol Universal 30 mL dengan gel silika non indikator dan sterilkan dalam oven 180oC, 2-3 jam Simpan botol di dalam baki yang berisi air sampai ketinggian gel silika dan simpan baki selama semalam dalam freezer –20oC Siapkan suspensi mikroba berspora dalam 5% susu skim dingin (5oC) Tambahkan 1 mL suspensi mikroba menggunakan pipet pasteur ke dalam botol gel silika ketika botol masih dalam air beku Setelah 20 menit pindahkan botol dari es dan kocok untuk menyebarkan suspensi, dan beri label botol Inkubasi botol pada 25oC sampai kristal-kristal terpisah ketika dikocok ( sekitar 1 – 2 minggu) Simpan botol pada 4oC dalam kontainer kedap udara berikut gel silika berindikator untuk menyerap air B. Recovery Letakkan beberapa kristal dari kultur stok kerja dalam medium pertumbuhan dan inkubasi pada kondisi pertumbuhan yang sesuai Jika mikroba gagal tumbuh, gores kristal gel silika pada medium agar

PENYIMPANAN DENGAN TEKNIK KRIOPRESERVASI (PENYIMPANAN BEKU) Metoda penyimpanan ideal, yaitu penyimpanan beku sel pada suhu yang tidak memungkinkan perubahan kimia atau fisika. Faktor penting dalam “cryopreservation”: penentuan kondisi pertumbuhan optimum pada saat penghilangan air selama pendinginan, “cryoprotectant yang digunakan, umumnya gliserol atau dimetilsulfoksida teknik pendinginan dan pelelehan yang sesuai. Laju pembekuan berpengaruh terhadap sel Pembekuan yang lambat  sel mengkerut Pembekuan yang cepat  menginduksi es intraseluler Mikroba disimpan pada suhu subzero (suhu penyimpanan –135oC sampai –196oC). Pelelehan secara cepat diperlukan untuk mencegah rekristalisasi es Mikroba lebih tahan hidup dibandingkan metode freeze drying

Protokol 4 Kriopreservasi “Cryopreservation” Siapkan spora atau suspensi sel dalam 10% (v/v) gliserol Pipet 0,5 mL suspensi sel ke dalam 2 mL “cryotubes” steril Dinginkan pada freezer dengan laju yang terkontrol sampai –50oC. Laju pendinginan umumnya -10oC/min Pindahkan ke dalam rak metal dalam freezer penyimpanan nitrogen cair Recovery Lelehkan “cryotubes” secara cepat dengan menempatkannya pada “water bath” 37oC atau pada lemari penghangat dengan pengontrol suhu

PERBANDINGAN BEBERAPA TEKNIK PENYIMPANAN KULTUR Biaya Stabilitas Metode Material Tenaga Ketahanan genetik Transfer periodik rendah tinggi ± 6 bulan buruk “Dried on host” Variabel baik “Living on host” 0-20 th Minyak sedang 2-20 th Air steril 2-5 th Tanah steril 5-7 th Silika gel “Freeze-drying” tinggi (awal) 4-40 th Pembekuan 4-5 th Kriogenik infinite

persetujuan karantina MANAJEMEN KULTUR Kurator persetujuan karantina (bila diperlukan) permintaan kultur depositor data utama formulir pengujian kultur jadwal perawatan stok stok kultur permintaan kultur laboratorium katalog numerikal dan alfabetikal permasalahan kultur uji viabilitas uji kemurnian program uji kultur uji kesintasan program preservasi bila rendah penyimpanan ampul kartu stok ampul distribusi ampul