Kuliah ke – 14 biotek reproduksi ternak Dosen Pengampu : Setyo Utomo

Prosedur penampungan embryo adalah sebagai berikut : Persiapan Anastesi Epidural. Pemasukan Cateter Ballon dan Fikasasi ballon. Prosedur Flushing Perlakuan Setelah Flushing Pencarian dan Penanganan Embryo

1) Persiapan Sapi donor ditempatkan pada squeeze chute (kandang penjepit). Tempatkan kaki depan lebih tinggi dibandingkan dengan kaki belakangnya agar saluran reproduksi mudah didapatkan. Palpasi dilakukan untuk mengetahui panjangnya saluran reproduksi, lokasi dan kondisi. Juga perkiraan jumlah CLs dan folikel yang tidak ovulasi pada setiap ovarium di catat. Sekitar 1000 ml medium flushing yang dibutuhkan untuk setiap betina donor, dipanaskan pada temperatur 37C dalam water bath sebelum digunakan. Botol medium dihubungkan dengan tabung pemasukan (dapat digunakan tabung infus pada bidang medis manusia) diisikan kedalam cateter Foley. Tabung pengeluaran dihubungkan dengan tabung pemasukan melalui konektor “Y” atau “T” (Gb. 3). Kedua tabung pemasukan dan pengeluaran diisi dengan medium sebelum dimulai penampungan. Cateter ballon akan dibilas dengan medium penampungan dan stylet pencampur bagian dalam dari kateter sebelum digunakan. Fiksasi pada stylet oleh tabung penghubung atau Forceps Kocher’s.

2. Anastesi Epidural. Bagian depan ekor dijepit kemudian dibersihkan dengan sabun antiseptik, dibersihkan dengan kain beralkohol dan anastesi epidural diberikan diantara tulang sacrum dan tulang vertebrae coccygeal pertama (lihat gb. 4) dengan menggunakan 5 ml Xylocaine 2% Posisi penyuntikan disesuaikan dengan tempat tekanan negatif. Jika tempat penyuntikan sesuai, kemudian beberapa tetes ditambahkan sesuai yang diinginkan. Lakukan penyemprotan sehingga semua sisa dapat terdorong masuk. Feces dibuang dari dalam rectum sebelum anastesi lokal dilakukan untuk menghindari terjadinya gelembung udara pada rectum, ketika rektum dipenuhi banyak udara, udara dapat dikeluarkan dengan pompa vakum. Setelah efek anastesi berhasil, ekor dari sapi donor diikatkan pada bagian badan. Ketentuan penggunaan anastesi epidural dengan Xylocaine jika dilakukan injeksi secara intravena atau intramuskular dengan menggunakan 20 ml Prifinium Bromida (“Padrin” yang merupakan parasympathiocolytic) menghambat terjadinya tekanan yang berlebihan pada rectum dan membuat penanganan uterus lebih mudah.

3. Pemasukan Cateter Ballon dan Fikasasi ballon. Vulva dan rectum harus dibersihkan dengan air hangat dan digosok dengan handuk yang diberi antiseptic dan diikuti kain beralkohol.Operator memasukan satu lengan ke dalam rektum. Kemudian pada bibir vulva diletakkan alat bantu berupa penguak serviks yang dimasukan melalui vagina dan ditempatkan ke dalam lumen serviks. Gunakan alat penekan dan penguak untuk memanipulasi cincin-cincin serviks guna memasukkan kateter Folley. Enam belas sampai 20 G (tergantung ukuran serviksnya) kondisi steril dengan kateter dua lumen dengan sebuah stylet dimasukan ke dalam vagina dan seterusnya dimasukan kedalam lumen serviks kemudian ke bagian corpus uterus dibantu melalui palpasi rektal seperti halnya IB. Kemudian kateter diarahkan memasuki tanduk uterus demikian juga dengan balloonnya yang di atur kira-kira 2 – 3 cm melewati bifurcatio bagian luar dari cornua uterus. Pada sapi Holstein cornua uterinya tidak sepanjang setelah melahirkan, lokasi ballon akan berada dibagian dalam sebab involuasi tidak sempurna. Penerapan Aplikasi Forcep serviks memberikan hasil yang baik. Harus diperhatikan jangan sampai melukai endometrium saat memasukan kateter. Dengan segera setelah kateter dimasukkan pada posisi yang memadai, asisten menyuntikan 10 ml udara kedalam balon untuk yang pertama, kemudian secara perlahan-lahan ditambahkan udara hingga tekanannya mencapai volume total, sampai kita merasakan bagian tanduk uterus menggembung secukupnya . Kemudian ditambahkan 3- 6 ml udara sesuai kebutuhan. Ballon harus di rapatkan sehingga medium tidak dapat keluar diantara ballon dan dinding dari tanduk uteri. *Pemompaan ballon akan dapat melukai endometrium dan menyebabkan pendarahan. Ketepatan volume udara tergantung dari ukuran uterus dan posisi ballon. Umumnya untuk kebutuhan yang tepat diperlukan 12 – 14 ml udara untuk heifer dan sekitar 14 – 16 ml untuk anak sapi.

4) Prosedur Flushing Pada saat pergantian tanduk uterus, pengambilan inner stylet dilakukan secara pelan-pelan jangan sampai mencabut balon. Sebelum dihubungkan dengan balon, kateter dimasukan kedalam tabung, yang diisi dengan medium. Aliran medium dalam tabung ditutup dengan clamp, dan tabung pemasukan dibuka. Setelah tanduk uterus diisi dengan medium, aliran dihentikan. Setelah tabung pengeluaran dibuka, kita urut dan menggerakan uterus untuk dikeluarkan guna mendapatkan ova yang berada pada lipatan endometrium. Jangan sampai menyentuh uterus tanpa membuka saluran pengeluaran (outlet tube). Pengaturan pengisian medium pada uetrus dapat memungkinkan terjadinya embryo kembali lagi ke oviduct. Flushing medium bervariasi dari 20 – 50 ml tergantung ukuran tanduk uterus dan posisi ballon. Selama flushing pertama, pemasukan medium hanya sekitar 20 – 30 ml dan secara bertahap meningkat volumenya sampai sekitar 40 – 50 ml. Medium yang berisi ova kita keluarkan dari tanduk uterus. Setelah tanduk uteri yang sudah berisi medium maksimal, kita amati aliran medium yang keluar. Proses ini diulang 8 – 10 kali sampai jumlah medium flushing yang digunakan mencapai 400 – 500 ml. Pada saat syringe pada bagian akhir kateter folley ditekan atau diarahkan ke uterus yang akan diflushing, dalam pengisian medium jangan terlalu cepat karena dapat mengakibatkan kerusakan endometrium. Setelah satu tanduk uteri selesai, kemudian tanduk uteri yang lain kita isi medium, harus digunakan kateter folley yang baru dan steril.

5. Perlakuan Setelah Flushing Uterus diinfus dengan 50 ml 2% PVP-Iodine atau antibiotic (Penicillin 200.000 U + Streptomycin 0,2 g atau Ampicillin 500 mg, dsb). Jika luka pada membran berlebihan, pemberian antibiotik lebih dianjurkan sebab efek larutran iodine menyebabkan iritasi membran. Suntik donor dengan 15 – 25 mg PGF2 atau 500 – 750 g PGF2 atau 500 – 700 g PGF2 analog (estrumate) untuk mencegah terjadinya kebuntingan dan memulihkan kondisi saluran reproduksi.

6. Pencarian dan Penanganan Embryo Dari medium flushing kita harus segera menemukan embryo-embryo secepatnya agar tidak terlepas dari pengamatan. Hal ini disebabkan karena didalam media hasil flushing mengandung banyak mukus, lendir, darah dan debris (reruntuhan) dan kondisi tersebut dimungkinkan akan merusak kualitas embryo-embryo yang berhasil ditampung. Embryo-embryo yang berhasil ditemukan sebaiknya segera dipindahkan ke medium penyimpanan segar dan dilakukan pencucian untuk beberapa kali. Selama proses ini harus tetap dijaga kebersihannya dan ditangani secara tepat.

Preparasi (peralatan) untuk Pencarian Embryo Botol glass / silinder ukuran 500 – 1000 ml. Emcon filter Klam atau gunting kocher’s Pipet bola (digunakan untuk mencuci filter Emco, dempet dengan karet silicon lampu pijar). Mikro pipet (ujung pipet dipanaskan diatas api kecil sehingga melengkung. Sebelum digunakan sebaiknya disumbat dengan kapas dan disterilkan dengan cara pemanasan. Aspiration Tube dengan Mouthpiece Petri Dish 90 X 15 mm (dish pencarian ) ( permukaan bagian luar bagian bawah terdapat garis-garis persegi 15 mm). Petri dish 35 X 12 mm (dish penyimpanan) (digunakan untuk menyimpan dan mengobservasi embryo). Pipa Test Rak atau tempat pipa Medium penyimpanan (M-PBS) + 20% Calf Serum) Mikroskop stereoscopik Pemanas Slide

Pencarian Embryo 1. Metoda Cylinder Stationary Media hasil pembilasan dimasukkan kedalam tabung silinder berukuran 1000 ml yang selanjutnya dimasukkan pada water bath dengan suhu 37C atau pada temperature ruang, dan dibiarkan selama 30 menit. Selama waktu tersebut seluruh embryo akan mengendap di bagian bawah atau permukaan sebelah bawah dari tabung silinder. Setelah 30 menit, semua medium disedot dengan pelan menggunakan pipa tetes (selang) atau pipa silikon yang terdapat klem dan disisakan sekitar 50 ml medium bagian bawah. Sisa medium dialirkan ke dalam dish pencarian (searching dish). Setelah silinder kosong kemudian dicuci dengan 20 –30 ml medium sebanyak 3 kali menggunakan sebuah pipete ball. Medium pencuci inipun kemudian dituangkan ke dalam dish.

2. Metoda Mesh Filtration Menggunakan sistem filter (“EmCon Immuno System) dapat mempercepat proses isolasi embryo. Sistem ini menggunakan media hasil flushing (pemulihan) dengan saringan berukuran 70  mesh. Putar botol perlahan tanpa membuat gelembung gelembung udara dan tuangkan seluruh media hasil flushing (pemulihan) ke dalam filter. Selama filtrasi, filter harus tidak pernah kosong. Selalu dijaga agar terdapat sisa media di dalam filter. Akhirnya akan terdapat sekitar 40 – 50 ml media hasil flushing (pemulihan) yang berisi embryo akan tersisa di dalam filter. Embryo-embryo seringkali terdapat dalam mukus, sehingga seluruh mukus yang melekat dalam mesh harus dicuci bersih menggunakan pipet bolam (ball pipette).. Sisa media dan media pencuci dituangkan ke dalam satu atau dua cawan pencarian (searching dish), permukaan bawah cawan telah digambar dengan garis kotak 10 – 15 cm. Cawan ini diuji untuk mengetahui adanya embryo di bawah stereomikroskop dengan pembesaran 10 – 15 X. Sebuah stick kaca steril yang satu ujungnya bidang digunakan untuk mencari embryo dalam mukus.

Penanganan Embryo Sebelum mencari embryo, cawan kecil yang berisi 3 – 5 ml media penyimpanan (D-PBS ± 20% calf serum) disiapkan dan dipanaskan pada 37C menggunakan pemanas slide. Jika embryo dapat terdeteksi, maka penanganannya adalah sbb. : Meletakkan sebuah mouthpiece pada mikropipet dan mencuci pipet tetes dengan media penyimpanan 2 sampai 3 kali. Tuang sejumlah media penyimpanan kemudian embryo dideteksi dan diambil dengan mikro pipet. Kemudian dipindahkan embryo ke medium penyimpanan. Pencampuran dengan mukus dan debris yang bersama embryo tidak dapat dihindarkan, sehingga dalam isolasi embryo harus dilakukan pencucian beberapa kali sampai media menjadi jernih atau bersih. Akhir seluruh proses penanganan embryo adalah melindungi embryo dari kerusakan sebelum transfer atau freezing.

EVALUASI EMBRYO DAN TEKNIK TRANSFER EMBRYO 1. Tingkat Perkembangan Morula, umumnya disebut “Ball of Cels”. Blastomere-blastomere individu sulit dibedakan dengan yang lain. Masa Cell Embryo menempati seluruh ruang perivitellin. Compact Morula : Blastomere-blastomere individu bergabung, membentuk massa yang kompak. Massa embryo menempati 60 – 70% ruang perivitelline, yang lebih besar dari pada tingkatan morula. Early Blastocyst, merupakan sebuah embryo yang berbentuk rongga berisi cairan, sehingga disebut Blastocoel dan kelihatan seperti cincin cap. Embryo menempati 70 – 80 % ruang perivitelin. Diferensiasi visual antara tropoblast dan Inner Cell Mass terjadi pada tingkatan perkembangan ini. Blastocyst; diferensiasi nyata dari bagian tropoblast (outer tropoblast layer) dan lebih gelap, lebih kompak Inner Cell Mass nya dan jelas. Blastocoel menonjol dengan embryo mengisi lebih banyak ruang perivitelin.

Expanded Blastocyst, secara keseluruhan diameter embryo secara cepat meningkat 1,2 – 1,5 kali, bersamaan dengan menipisnya zona pellucida, kira-kira 1/3 bagian dari ketebalan asli. Embryo-embryo pada tingkatan ini seringkali kelihatan collaps (runtuh). Ini mencirikan pada blastocoel komplit atau blastocoel yang hilang sebagian, bagaimanapun zona pelucida jarang mendapatkan kembali ketebalan aslinya. Hatched Blastocyst, embryo yang ditemukan pada tingkatan ini dapat mengalami proses penetasan (Hatching) dengan terbukanya zona pelucida secara sempurna. Hatched blastocyst berbentuk bulatan dengan bagian blastocyst yang runtuh. Identifikasi embryo pada tingkatan ini dapat menjadi sulit terutama untuk teknisi yang belum berpengalaman.

2. Evaluasi Embryo Grade 1 (Excellent) : bentuk embryo paling normal baik besar maupun bentuknya. Embryo ideal, berbentuk bola, simetris dengan ukuran, warna dan teksture seragam. Grade 2 (Good) : bentuk embryo normal agak gelap, sedikit kurang sempurna, seperti beberapa blastomere extruded, bentuk ireguler, terdapat beberapa gelembung. Grade 3 (Fair) : ukuran embryo sedikit lebih kecil, ada inklusi vesikula, zona pellucida sedikit robek atau tepi teratur beberapa blastomere extruded, terdapat rongga (vesiculasi), beberapa sel degenerasi (10-20% tidak beraturan) Grade 4 (poor) : embryo berwarna gelap, bentuk tidak teratur lebih kecil, zona pellucida robek banyak blastomere extruded, sel degenerasi, ukuran sel bervariasi, banyak gelembung besar tetapi masa embryo kelihatan seperti hidup (30 – 50% tidak beraturan). Grade 5 (dead) : bentuk dan besar embryo tidak teratur, zona pellucida rusak.

Penentuan jenis kelamin embryo (embryo sexing) Perlakuan Embryo sebelum dipindahkan Penyimpanan Embryo Penentuan jenis kelamin embryo (embryo sexing) Bedah mikro (Micro surgery embryo).

TEKNIK TRANSFER EMBRYO Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan transfer embryo : Kualitas embryo Media transfer Sinkronisasi estrus pada donor dan resipien Infeksi pada tubuh sapi Tempat transfer Perbedaan teknik antara surgical dengan non surgical Sapi heifer dan sapi resipien Status nutrisi resipien

Seleksi resipien yang optimum akan menghasilkan sapi betina muda yang terbebas dari penyakit dengan fertilitas tinggi dan mempunyai sifat mothering ability (sifat keibuan) yang baik, juga pertumbuhannya baik dan bentuk tubuhnya memungkinkan untuk mudah dalam melahirkan. Meskipun bangsa bukan merupakan faktor yang penting namun biasanya crosbreed akan menunjukkan fertilitas yang lebih baik. Kesehatan dan kondisi reproduktif sapi betina calon resipien harus diperiksa pada saat membeli maupun saat seleksi dilakukan. Pemeriksaan diarahkan pada kondisi abnormalitas saluran reproduksinya, kondisi kebuntingan sebelumnya dan sejarah penyakit yang pernah dideritanya. Apabila calon resipien baru diperoleh, maka harus dilakukan karantina. Selama periode karantina sapi betina calon resipien harus diperiksa secara detil setiap hari dari tanda-tanda penyakit, temperatur tubuhnya yang tinggi jika terjadi infeksi karena akan berkaitan dengan infertilitas dan aborsi.

Keberhasilan transfer embryo sebagian besar juga tergantung pada sinkronisasi estrus antara donor dengan resipien. Hal penting yang perlu diketahui adalah normalnya siklus estrus. Keberhasilan akan dicapai jika resipien mengalami estrus kurang lebihnya sekitar 1 hari dari sapi donor. “Standing heat” adalah satu-satunya identifikasi estrus. Seekor sapi yang mengalami standing heat bila dinaiki sapi betina yang lain maka akan diam pasrah, seperti seekor pejantan mengawini seekor betina. Walaupun dengan pandangan mata telanjang kondisi standing heat ini merupakan tanda terbaik untuk deteksi estrus. Terdapat beberapa alat komersial yang tersedia untuk kepentingan deteksi estrus, diantaranya adalah “Heat Mount Detector” dapat juga digunakan.

Sinkronisasi estrus resipien. Injeksi tunggal PGF 2 σ dengan palpasi, resipien yang sedang dalam pertengahan siklus estrus memperlihatkan corpus luteum pada ovarinya, akan merespon injeksi PGF 2 σ . Seleksi pertama pada kelompok resipien dilakukan dengan memeriksa ovarinya. Sapi yang terlihat corpus luteumnya disuntik dengan PGF 2 σ dengan dosis 15 – 25 mg atau dengan estrumate dengan dosis 500 μg dan estrus akan datang pada 48 – 96 jam kemudian. Penyuntikan dobel dengan PGF 2 σ, suntik seluruh resipien dengan PGF 2 σ tanpa memperhatikan adanya corpus luteum kemudian diulangi lagi 11 hari kemudian, gejala estrus akan puncak lagi pada 48 – 96 jam kemudian.

Metoda transfer embryo pada ternak yaitu : 1.Surgical Methode (dengan teknik pembedahan) 2.Non-Surgical Methode (teknik tanpa pembedahan). Metode surgical telah berhasil menghasilkan angka kebuntingan yang lebih tinggi jika teknisi yang mengerjakannya profesional, seperti halnya pada metode non-surgical.

Preparasi dan Prosedur Transfer Embryo Alat : Transferring Gun Plastic sheath Outer sheath Gunting untuk gunting rambut Plastic straw Straw cutter Disposible syringe (5 – 10 ml) dengan jarum injeksi Cervix expander (pembuka serviks) Obat-obatan Kapas dengan 70% etil alcohol Paper towel dipped dengan disinfektan (benzalkonium chloride) 2 % xylocaine (lidocaine HCl) “Padrine” (Prifinum Bromida-anticonvulsivant)

b. Pengisian Embryo ke dalam straw (Preparasi Straw Straw harus dicuci dengan air murni tanpa pembasahan dengan kapas, keringkan dan sterilkan dengan gas ethylene oxide atau UV. Sterilisasi dengan gas ethylene oxide harus diselesaikan lebih dari 2 minggu sebelum digunakan, karena sisa gas dapat merusak embryo. Kemudian straw dipotong sekitar 1 – 2cm, sehingga tepat untuk transferring gun. Pertama, straw harus dicuci beberapa kali dengan media aspirat tanpa pembasahan cotton plug. Kemudian embryo dimasukan dalam straw dengan 1 ml tuberculin syringe ditempelkan pada cotton plug di ujung straw. Embryo dan media adalah aspirated : 2 – 3 cm kolom media (M-PBS) sebagai aspirated, kemudian 0,5 cm gelembung udara, dan 2,5 – 3,5 cm media yang berisi embryo diikuti oleh gelembung udara yang lain dan media. Media terakhir menjamin bahwa media aspirat I basah oleh kapas.

c. Persiapan Transfering gun Embryo yang dimasukan dalam straw ditempatkan dalam transfering gun dan ditutup dengan outer sheat, harus dijaga agar tidak terkena kontaminasi. Apabila betina resipien dipelihara dekat dengan laboratorium Transfer Embryo, maka cara kerja seperti tertulis di atas, tetapi jika membutuhkan waktu untuk transportasi dari tempat koleksi ke tempat transfer atau laboratorium untuk cryopreservasi, straw harus disegel dan dibawa secara hati-hati dengan posisi horisontal.

d. Persiapan Resipien Cek terakhir pada calon resipien adalah membawa keluar 1 hari atau bahkan sebelum transfer. Apabila pemeriksaan dengan palpasi rektal keluar sebelum transfer, jangan menyentuh atau memijit ovari dan uterus secara kasar. Kendalikan resipien dalam services create (kandang jepit) dan keluarkan seluruh feses, berikan anastesi epidural dengan menggunakan 3 ml xylocaine pada resipien. Vulva dan daerah rektal dicuci seluruhnya dengan air hangat, dan digosok dengan tissue yang telah dimasukan dalam disinfektan dan kemudian bilas dengan kapas yang telah diberi etilalkohol.

e. Sinkronisasi Sinkronisasi antara tingkat perkembangan embryo dan siklus birahi resipien. Jika tingkat perkembangan embryo dan siklus estrus resipien bervariasi, mereka harus disinkronisasikan sebanyak mungkin. Sebagai contoh pada hari ke – 7 flushing dan ET segar telah terbentuk, jika hari ke- 6 – 8 resipien telah tersedia, morula harus ditransfer pada hari ke-6, tahapan morula kompak dan awal blastocyst pada hari ke – 7 dan blastula akhir pada hari ke-8.

f. Prosedur Transfer. Sementara teknisi memasukan tangan pada rektum, bibir vulva resipien dibuka dan transferring gun dimasukkan ke dalam vagina. Gun harus dimasukan ke pintu masuk serviks, dengan plastik penutup (plastik sheat) kemudian gun dimasukan ke dalam serviks. Setelah melewati serviks, transferring gun dimasukan ke tanduk uterin secara ipsilateral (searah) dengan Corpus luteum. Tanduk uterus dinaikkan dan kemudian diluruskan disamping ujung gun. Ujung gun harus dimasukkan sekitar 5 – 10 cm melebihi bifurcatio. (Gb. 25). Selama proses pemasukan gun tersebut tidak boleh melukai dinding uterin, jika terjadi penolakan maka tidak boleh dipaksakan. Jika diinginkan dengan posisi yang tepat tercapai maka embrio dimuntahkan dengan cara menekan gun plunger dengan kuat. Jika pada servikas yang sempit dan rapat pada saat memasukan gun maka alat pembuka serviks dapat digunakan untuk memperlancar prosedur ini.

Teknik Pemasukan Alat Saat pelaksanaan transfer embryo dilaksanakan, teknik yang sangat penting adalah memasukan peralatan seperti kateter balon dan transferring gun ke dalam serviks dan tanduk uterin. Jika hal ini dilakukan tidak secara benar maka akan berakibat melukai serviks dan endometrium, sehingga akan mengakibatkan pendarahan. Jangan mudah menggeser peralatan tanpa mengetahu lokasi yang sebenarnya di dalam saluran reproduksi, juga jangan terlalu yakin bahwa peralatan sudah pasti masuk ke dalam saluran, akan tetapi saluran yang harus dimanipulasi dan disesuaikan agar alat tadi dapat melaluinya dengan baik dengan menggunakan bimbingan tangan anda yang berada dalam rektum.

1. Pemasukan alat pada saluran uterin eksternal. Apabila alat telah dimasukan ke dalam serviks, posisi tangan memegang alat tersebut melalui rektal adalah sangat penting. 2. Pemasukan alat pada serviks Perpindahan alat yang terlalu sering dalam satu proses transfer seperti naik turun, kekanan dan kekiri maka akan berakibat dapat melukai serviks dan berakibat pendarahan. Pemindahan posisi alat dalam saluran harus dilakukan secara lambat dan halus/lembut dengan memanipulasi saluran sesuai dengan alat yang ada. 3. Pemasukan alat pada tanduk uterin (Cornua uteri) Apabila tanduk berada dibawah atau pada dasar abdomen maka seluruh uterus harus ditarik ke arah belakang, dengan memegang serviks dan tanduk uterus dipanjangkan dan diluruskan. Ujung alat harus selalu melewati bagian tengah lumen.

SOAL-SOAL LATIHAN Jelaskan prosedur penampungan embryo pada sapi ! Bagaimana mekanisme penmpunga embryo menggunakan metoda non surgical methode Mengapa metoda pembedahan jarang digunakan ? Jelaskan cara sinkronisasi estrus pada betina resipien ! Jelaskan prosedur transfer tanpa pembedahan ! Jelaskan factor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan transfer embryo ! Kirim jawaban anda ke esutama_set@yahoo.com, paling lambat satu minggu setelah hari Selasa, 23 Juni 2015.