PEMERIKSAAN LABORATORIUM DALAM DIAGNOSIS HEMOFILIA I Nyoman Wande Bagian Patologi Klinik FK Unud/ RSUP Sanglah Denpasar

Pendahuluan Hemofilia Kelainan herediter berupa gangguan pembekuan darah, ditandai dengan manifestasi perdarahan, disebabkan oleh kelainan atau defisiensi faktor koagulasi. Macam-macam hemofilia : - hemofilia A : def. FVIII - hemofilia B : def. FIX - hemofilia C : def. FXI - acquired hemophilia : karena adanya antibodi terhadap FVIII (tanpa ada defisiensi FVIII)

Pola pewarisan hemofilia (A dan B) Gambar . Skema transfer gen hemofilia dari ibu karier dan bapak menderita hemofilia (Mansouritorghabeh, 2015).

Gambar. Skema pewarisan gen hemofilia dari bapak hemofilia dengan ibu karier (Mansouritorghabeh, 2015).

Faktor koagulasi VIII (FVIII) Merupakan glikoprotein Dikode oleh gen 186.000 bp Protein faktor VIII dibagi menjadi: Rantai berat (A1-A2-B) Rantai ringan (A3-C1-C2) Bentuk aktif FVIII mengandung glycosylated sites-free domain B  as. Amino Arg740 untuk Glu1649. FVIII: C  membentuk kompleks dengan von Willebrand (vWF). Waktu paruh F VIII: Dengan vWF: 12 jam Tanpa vWF: 2 jam

Perbandingan Faktor VIII dengan vWF

Gambar skematik dua bentuk yang berbeda dari faktor VIII Gambar skematik dua bentuk yang berbeda dari faktor VIII. (Pisarek et al., 2016)

186 kb 26 ekson Terletak di regio Xq2.8 Gen FVIII

Rentang normal F VIII yaitu berkisar 50%-150% dari nilai normal (bervariasi sesuai umur) FVIII meningkat pada keadaan (Williamson et al., 2011): Status inflamasi sebagai reaktan fase akut Penggunaan kontrasepsi oral Kehamilan trimester terakhir FVIII menurun pada keadaan (Williamson et al., 2011): Hemofilia A Disseminated intravascular coagulation (DIC) Acquired factor VIII inhibitor Von willebrand disease Beberpa wanita karier gen hemofilia (ringan)

Faktor Koagulasi IX (FIX) Protein yg tergantung Vit. K, dlm bentuk zymogen yg tdk aktif Aktivitasnya berlangsung pada membran fosfolipid, diawali dengan membentuk komplek dg faktor jaringan (TF/VIIa) Rentang normal: 70%-120% dri nilai normal

Peningkatan FIX terjadi pada: Penurunan FIX terjadi pada keadaan: Kehamilan Penggunaan kontrasepsi oral Penurunan FIX terjadi pada keadaan: Hemofilia B Penyakit hati Penggunaan antagonis vitamin K (warfarin) atau defisiensi vitamin K Amyloidosis Syndrome nefrotik Alloantibodi pada hemofilia B yang diterapi dengan infus faktor IX Autoantibodi terhadap faktor IX pada individu yang sebelumnya sehat (sangat jarang)

Kaskade koagulasi

Kadar FVIII sangat rendah Hemofilia A Defisiensi faktor VIII  80% dari kasus hemofilia Gangguang X-linked Inversi (± 50%) Mutasi titik Kadar FVIII sangat rendah insersi delesi

Hemofilia B Defisiensi FIX Abnormalitas dari gen FIX pada kromosom X: Delesi (besar atau kecil) Mutasi titik Mutasi missense

Gambaran klinis penderita hemofilia Hemarthrosis, hematoma Perdarahan CNS, hematuria Perdarahan post Op. Perdarahan pd cabut gigi Terbentuk inhibitor antibody thd FVIII atau FIX

Bagaimana terjadi perdarahan pada penderita hemofilia?

Haemarthrosis pada hemofilia berat

Perdarahan pada otot paha

Differential diagnosis Hemofilia: Hemofilia B Kelainan koagulasi kongeninal lainnya: defisiensi FXI dan FXII Von Willebrand disease Aquired inhibitor FVIII Kombinasi defisiensi kongenital FVIII dan FV Hemofilia B: Hemofilia A Defisiensi faktor koagulasi tergantung vit. K (didapat/ diturunkan) Penyakit hati Overdosis warfarin

Tabel. Klasifikasi klinis hemofilia A dan hemofilia B berdasarkan kadar faktor koagulasi. Kadar faktor VIII Hermofilia B Kadar faktor IX Gambaran klinis Severe (berat) ≤ 1% dari normal (≤0.01 U/ml) Spontaneous hemorrhage from early infancy Frequent spontaneous hemarthroses and other hemorrhages requiring clotting factor replacement. Moderat (sedang) 1-5% dari normal (0.01-0.05 U/ml) Hemorrhage secondary to trauma or surgery Occasional spontaneous hemarthroses Mild (ringan) 6-30% dari normal (0.06-0.30 U/ml) (0.06-0.40 U/ml) Rare spontaneous hemorrhage Dikutip dari: Williams Manual of Hematology, sixth edition. 2003 (Lichtman et al., 2003).

Diagnosis dan pemeriksaan laboratorium pada hemofilia Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan hemofilia dilakukan pada (Kitchen and McCraw, 2000): Bayi laki-laki, riwayat keluarga (+), dengan atau tanpa gejala Remaja atau dewasa asimtomatik  perdarahan yang berlebihan pada saat trauma atau tindakan. Individu asimtomatik  pemanjangan APTT. Diagnosis pasti hemofilia: Assay kadar FVIII atau IX Assay cytogenetic

Algoritme diagnosis laboratorik hemofilia Pemeriksaan penyaring hemostasis APTT memanjang PPT normal APTT dari campuran plasma pasien dan plasma normal Terkoreksi Tidak terkoreksi Tes substitusi Inhibitor Asai faktor

Pemeriksaan yang mendukung diagnosis hemofilia: Pemeriksaan penyaring: CT, PT, APTT Mixing test Differential APTT Pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX Pemeriksaan inhibitor FVIII atau FIX

1. Pemeriksaan penyaring hemostasis: Masa pembekuan (clotting time): melihat defisiensi FVIII dan FIX Masa prothrombin plasma (prothrombin time/ PT): Jalur ekstrinsik dan jalur bersama (Faktor II, V, VII, X)  memanjang jika 10% dibawah normal Masa tromboplastin partial teraktivasi (activated partial thromboplastin time/ APTT): defisiensi jalur intrinsik, terutama FVIII memanjang jika FVIII < 25%

2. Mixing test Tujuan Membedakan defisiensi faktor koagulasi dengan adanya inhibitor. Metode Dilakukan dengan mencampur plasma pasien dengan plasma normal dengan perbandingan 1:1, kemudian diinkubasi. Interpretasi APTT memanjang inhibitor faktor VIII Koreksi APTT  defisiensi atau tidak menyingkirkan inhibitor apabila klinis sesuai

3. Differential APTT Tujuan: untuk menentukan jenis defisiensi faktor sebelum assay faktor 200 µL adsorbed plasma 200 µL aged plasma 200 µL plasma pasien Masing-masing dilakukan pemeriksaan APTT Skema pemeriksaan differential APTT

Tabel Interpretasi pemeriksaan differential APTT Plasma normal Adsorbed plasma (F I,V,VIII,XI,XII) Aged plasma (F II,VII,IX,X,XI,XII) Kelainan Terkoreksi Tidak terkoreksi < FVIII < FIX < FXI,XII Inhibitor

4. Pemeriksaan FVIII atau FIX Tujuan pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX: Menegakkan diagnosis defisiensi faktor Menilai beratnya gangguan/defisiensi Monitor terapi pengganti Mendeteksi karier Metode pemeriksaan: one-stage assay two-stage assay chromogenic substrate assay

Metode Pemeriksaan FVIII Chromogenic substrate Two-stage One-stage Fase I reagen (FV, CaCl₂, fosfolipid, serum) + plasma standar/plasma penderita (FVIII)  Fxa Fase II ditambahkan plasma substrat (FII & fibrinogen)  terbentuk bekuan Kecepatan terbentuknya bekuan tergantung jumlah Fxa, Fxa tergantung FVIII. Berdasarkan kemampuan plasma pasien dalam mengoreksi perpanjangan APTT dari plasma def.FVIII Prinsip mirip fase I two-stage method. Setelah terbentuk Fxa, Fxa diukur menggunakan substrat kromogenik spesifik.

Metode One-Stage Assay Memerlukan plasma defisien FVIII, reagen APTT, plasma standar, plasma normal. Alat yang dipakai koagulometer Interpretasi hasil menggunakan kurva standar dengan kertas grafik semilogaritmic atau double logaritmic.

Pemeriksaan FVIII 1. Plasma kontrol dan plasma pasien dibuat pengenceran 1:10, 1:20, 1:40 dengan lar.dapar 2. Ambil 100 µL plasma yg telah diencerkan + 100 µL plasma defisien FVIII + 100 µL reagen APTT  inkubasi pada 37⁰C selama 5’ 3. Tambahkan 100 µL CaCl₂ yang telah diinkubasi pada 37⁰C 4. Catat lama waktu terbentuk bekuan 5. Hasil dari plasma pasien maupun kontrol diplot pada kurva standar.

Interpretasi pengukuran kadar FVIII²⁰

5. Pengukuran kadar inhibitor FVIII atau FIX Inhibitor FVIII diperiksa dengan mencampur plasma pasien dengan plasma normal dengan perbandingan yang sama + FVIII  inkubasi. Bila plasma sampel mengandung inhibitor, FVIII akan cepat dinetralkan. Satuan: BU inhibitor FVIII yang menginaktifkan setengah dari jumlah awal kadar FVIII dalam normal pooled plasma Metode yang sering dipakai: metode Bethesda modifikasi Nijmegen. Metode pemeriksan inhibitor FIX sama dengan inhibitor FVIII

Grafik semilogaritmik untuk menghitung Bethesda Unit

Ringkasan Hemofilia: kelainan perdarahan kongenital yang terjadi oleh karena adanya penurunan atau tidak adanya faktor VIII atau faktor IX secara fungsional. Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan hemofilia pada: Bayi laki-laki riwayat hemofilia (+) gejala (-) atau gejala (+) Remaja atau dewasa asimtomatik yang mengalami perdarahan yang berlebihan pada saat trauma Individu asimtomatik yang mengalami pemanjangan APTT. Diagnosis lab penderita hemofilia: pemeriksaan penyaring: (clotting time (CT), PT, APTT) Mixing test Differential APTT Pemeriksaan FVIII, FIX, Pemeriksaan inhibitor FVIII dan inhibitor FIX.

Terima kasih