Pembuatan Kurva Tumbuh Saccharomyces cereviseae Kelompok 3 Prinsip Teknik Fermentasi .Yosi Ayu Aulia. .Siti Amalia Hasnida. .Vilandri Astarini. .Felix Johannes. .Andriani Oktadianti. .Tamara Aprilia. .Angga Kusnan Qodafi.

Pembuatan Kurva Tumbuh Saccharomyces cereviseae Tujuan Membuat dan menganalisis kurva tumbuh S.cereviseae. Menentukan umur inokulum terbaik S.cereviseae. Teori Dasar Pada pertumbuhan mikroba, secara umum terdapat 4 fase pertumbuhan yaitu: Fase Pertumbuhan Ciri Fase Lag (Lambat) Tidak ada pertumbuhan populasi  sel mengalami perubahan komposisi kimiawi dan ukuran. Bertambahnya substansi intraseluler  siap membelah diri.

Pembuatan Kurva Tumbuh Saccharomyces cereviseae Fase Pertumbuhan Ciri Fase Eksponensial (Logaritma) Sel membelah diri dengan laju yang konstan. Massa menjadi 2x lipat. Keadaan pertumbuhan seimbang. Fase Stasioner (Tetap) Akumulasi racun  metabolisme sel dan kandungan nutrien mulai habis. Kompetitisi nutrisi. Jumlah sel konstan Fase Kematian Sel mati  penumpukan racun dan kompetisi nutrisi. Jumlah sel menurun secara eksponensial. (Madigan, 2009)

Pembuatan Kurva Tumbuh Saccharomyces cereviseae Pembuatan kurva tumbuh ini membutuhkan pengukuran beberapa parameter sebagai berikut: Perhitungan Jumlah Sel Dilakukan dengan haemocytometer. Pengukuran dengan metode ini termasuk ke dalam metode pengukuran langsung. Melalui metode ini, jumlah sel yang hidup dan mati sama-sama terhitung. (Santiago, 2006)

Pembuatan Kurva Tumbuh Saccharomyces cereviseae Perhitungan Substrat Gula Sederhana yang Tereduksi Dilakukan dengan menggunakan metode Somogyi-Nelson. Metode ini merupakan metode kuantitatif yang banyak digunakan untuk menentukan gula tereduksi  glukosa, galaktosa, laktosa, maltosa. Prinsip Somogyi-Nelson: (i) Glukosa + O2  menggunakan larutan Cu (II) yang kemudian akan tereduksi menjadi ion Cu(I). (ii) Ion Cu(I) + O2  Cu (II) Menggunakan kompleks arsenomolybdat yang terbentuk dari reaksi : (NH4)6 Mo7O24 + Na2HAsO7 (ammonium molybdat) (sodium arsenat) (iii) Kompleks arsenomolybdat tereduksi menghasilkan warna biru . Absorbannya  spektrofotometer panjang gelombang 520 nm. (Sadavisam, 1985)

Pembuatan Kurva Tumbuh Saccharomyces cereviseae Pengukuran Tingkat Keasaman (pH) Pengukuran pH dilakukan menggunakan pH meter. Prinsip: potensial elektro kimia yang terjadi antara larutan yang terdapat di dalam elektroda gelas yang telah diketahui dengan larutan di luar elektroda gelas yang tidak diketahui  lapisan tipis dari gelembung kaca akan berinteraksi dengan ion hidrogen (Cahaya A.N, 2009).

METODE KERJA

Diambil setiap titik (4 jam sekali) Sampel Diambil setiap titik (4 jam sekali) Dilakukan pengujian untuk setiap sampel pada semua titik. Penghitungan jumlah sel (hemocytometer). Pengukuran pH Pengukuran kadar glukosa dengan metode Simogy-Nelson

Sampel Sacharomyces cereviceae 25 mL sampel diinokulasikan ke 250 mL PDB diaktivasi selama 3 jam diukur nilai OD nya (0,7) ditambahkan medium PDB 100 mL. 12 mL sampel diambil di setiap titik pengambilan sampel (4 jam sekali sebanyak 13 titik). Pengujian terhadap sampel di setiap titik

Penghitungan jumlah koloni dengan Haemocytometer Sampel di titik t diteteskan pada kedua bagian pada haemocytometer. diletakkan di bawah mikroskop. dihitung jumlah koloni pada kotak yang terlihat. penghitungan dilakukan pada kedua bagian haemocytometer. Hasil pengamatan Gambar koloni pada kotak-kotak di haemocytometer.

Pengukuran nilai pH Sampel pada titik t diambil 7 mL diukur nilai pH menggunakan pH meter Hasil pengamatan

Pembuatan kurva baku

Pengukuran Kadar Glukosa dengan Metode Simogy-Nelson 1,6 mL Reagen Simogy 1 0, 1 mL sampel pada setiap titik O,4 mL Reagen Simogy 2 dimasukkan ke dalam 9,9 mL akuades . 0,1 mL 2 mL Sampel yang sudah diencerkan (10-2) diambil 2 mL ditambahkan 1,6 mL reagen Simogy 1. ditambahkan 0,4 mL reagen Simogy 2. dipanaskan dalam penangas selama 20 menit. dimasukkan ke dalam es. ditambahkan 2 mL reagen Nelson. ditambakan 4 mL akuades diukur intensitas warnanya dengan spektrofotometer pada λ = 520 nm. sampel 9,9 mL Akuades Dipanaskan 20 menit. 4 mL Akuades 2 mL Reagen Nelson. Diukur dengan Spektrofotometer Disimpan pada es Hasil Pengamatan

Kurva Tumbuh, Reduksi Glukosa, Penurunan pH HASIL DAN PEMBAHASAN Kurva Tumbuh, Reduksi Glukosa, Penurunan pH

Kurva Pertumbuhan S.cerevisiae atas bawah average jumlah sel log jumlah sel   123 6150000 6.788875116 4 281 213 247 12350000 7.091666958 8 475 433 454 22700000 7.356025857 12 460 463 461.5 23075000 7.36314171 16 450 576 513 25650000 7.409087369 20 883 914 898.5 44925000 7.652488086 24 728 807 767.5 38375000 7.584048388 28 1145 1455 1300 65000000 7.812913357 32 1400 70000000 7.84509804 36 1100 55000000 7.740362689 40 1129 56450000 7.751663946 44 732 787 759.5 37975000 7.579497783 48 739 898 818.5 40925000 7.611988688

KURVA BAKU Faktor pengenceran = 100 x

[glukosa] pada Kultur S.cerevisiae Absorbansi [glukosa] 0.584 0.1594697 1 0.583 0.15909091 2 -0.139 -0.1143939 3 -0.172 -0.1268939 4 -1.045 -0.4575758 5 -0.081 -0.0924242 6 -0.16 -0.1223485 7 -0.171 -0.1265152 8 -0.138 -0.1140152 9 -0.102 -0.1003788 10 -0.204 -0.1390152 11 12 -0.219 -0.144697

Analisis: pH cenderung stabil berada dalam kisaran 4 s.d. 5 Waktu pH T00 10.30 4.69 T01 14.30 4.50 T02 18.30 4.45 T03 22.30 4.58 T04 02.30 4.61 T05 06.30 4.67 T06 4.70 T07 4.78 T08 4.71 T09 4.82 T10 T11 4.77 T12 Analisis: pH cenderung stabil berada dalam kisaran 4 s.d. 5 pH medium awal tidak di adjust. Pengukuran mengalami error (kesalahan prosedural)

t X = juml SEL log sel r = dx/dt µ=r/x 1/µ [glukosa] ppm 1/[s] pH 6150000 6.788875 0.302792 4.92E-08 20310983 15.9469697 0.062708 4.69 4 12350000 7.091667 0.264359 2.14E-08 46716793 15.90909091 0.062857 4.5 8 22700000 7.356026 0.007116 3.13E-10 3.19E+09 -11.43939394 -0.08742 4.45 12 23075000 7.363142 0.045946 1.99E-09 5.02E+08 -12.68939394 -0.07881 4.58 16 25650000 7.409087 0.243401 9.49E-09 1.05E+08 -39589.50758 -2.5E-05 4.61 20 44925000 7.652488 -0.06844 -1.5E-09 -6.6E+08 -9.242424242 -0.1082 4.67 24 38375000 7.584048 0.228865 5.96E-09 1.68E+08 -12.23484848 -0.08173 4.7 28 65000000 7.812913 0.032185 4.95E-10 2.02E+09 -12.65151515 -0.07904 4.78 32 70000000 7.845098 -0.10474 -6.7E+08 -11.40151515 -0.08771 4.71 36 55000000 7.740363 0.011301 2.05E-10 4.87E+09 -10.03787879 -0.09962 4.82 40 56450000 7.751664 -0.17217 -3E-09 -3.3E+08 -13.90151515 -0.07193 48 37975000 7.579498 0.032491 8.56E-10 1.17E+09 4.77 52 40925000 7.611989 0.634332 1.55E-08 64516649 -14.46969697 -0.06911

ANALISA KURVA TUMBUH Fase lag dari S.cerevisiae sangat pendek(Anonim 1), seperti yang dapat kita lihat dari hasil plot kurva pertumbuhan dengan fase stasioner yang lebih panjang (jika dianalisis, menurut literatur pada fase ini,sel S.cerevisiae lebih tahan terhadap kondisi lingkungan akibat adanya mekanisme penebalan dinding selnya sehingga lebih tahan terhadap fluktuasi PH dan agitasi yang pada fase eksponensial mengakibatkan lisisnya sel) >Jika ditinjau dari kurva tumbuh yang didapat,terdapat titik dimana sel ragi mengalami peningkatan kembali setelah memasuk fase stasioner. Hal ini mungkin diakibatkan karena terdapat dua sumber C pada medium yaitu pati dari ekstrak kentang dan dextrosa. S.cerevisiae umumnya cenderung menggunakan gula sederhana terlebih dahulu untuk pertumbuhannya.(Lord, 1981)

> Penurunan jumlah sel diakibatkan kemungkinan karena penumpukan etil alkohol sebagai metabolit hasil pemecahan dextrosa( teramati dari bau manis yang kian meningkat pada titik pengamatan akhir). Fig. 12. The effect of additional alcohol upon the level of saturating population in Saccharomyces cerevisiae in test tubes (Gausse,2005)

ANALISA HASIL SOMOGY NELSON Hasil Somogy Nelson menunjukkan penggunaan dextrosa dan ekstrak kentang sebagai sumber C bagi pertumbuhan sel ragi. Hasil pembacaan Somogy Nelson yang tidak akurat kemungkinan besar terjadi diakibatkan terbentuknya gelembung CO2 pada larutan sehingga mempengaruhi pembacaan absorbansi.

ANALISIS PH Hasil pengukuran PH menunjukan angka fluktuatif pada kisaran 4-5. Menurut literatur, sel ragi sangat optimal tumbuh pada PH 4. Jika di bandingkan dari kurva pertumbuhannya, sel ragi paling optimum tumbuh pada titik t9 dengan PH 4,78. Hal ini mungkin diakibatkan karena pengamatan haemacytometer yang kurang teliti >Fluktuasi PH diakibatkan karena adanya pembentukan gliserol akibat aktivitas enzim aldehid dehidrogenase. Gliserol akan meningkatkan PH namun asam asetat yang juga trebentuk dari hasil metabolisme ragi meberikan suasana asam sehingga fluktuasi PH tidak terlalu signifikan Yalcin, Seda Karasu and Z. Yesim Ozbas. 2008. Effects of pH and temperature on growth and glycerol production kinetics of two indigenous wine strains of Saccharomyces cerevisiae from Turkey. Braz. J. Microbiol.  vol.39 no.2 .

KESIMPULAN Pertumbuhan ragi S.cerevisiae mengalami - masa lag pada t0 – t1 eksponensial pada t3 masa stasioner pada t9 masa kematian pada t10 [glukosa] pada substrat berbanding terbalik dengan pertumbuhan ragi pH substrat menurun seiring dengan pertumbuhan ragi.

Daftar Pustaka Cahaya A.N. 2009. Prinsip Kerja pH Meter. http://cahya-teknologikita.blogspot.com/2009/12/prinsip-kerja-ph-meter.html (tanggal akses: 21 Februari 2010). Madigan et al. 2009. Biology of Microorganisms 12th Edition. San Fransisco: Benjamin Cummings Publishing Inc. Sadavisam S and Theymoli Balasubramanian. 1985. Practical Manual (Undergraduate). Coimbatore: Tamil Nadu Agricultural University. Santiago, Perez. 2006. Cell counts using Improved Neubauer haemocytometer. http://people.oregonstate.edu/~weisv/Protocols/Symbiodinium/Cell%20Counts.pdf (tanggal akses: 21 Februari 2010).

Anonim. 2009. YEAST CELL [ONLINE]. Available at: http://www. saps Anonim. 2009. YEAST CELL [ONLINE]. Available at: http://www.saps.plantsci.sam.uk /worlsheets/ scotland/pdfs/double.pdf. Access time : February 20th 2010 (03:41) Gausse. 2005. ON THE MECHANISM OF COMPETITION IN YEAST CELLS [ONLINE].Available at: http://www.ggause.com/Contgau.htm. Access time : February 20th 2010 (03:41) LORD, P.G, and A. E. WHEALS. 1981. VARIABILITY IN INDIVIDUAL CELL CYCLES OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE. J. Cell Sci. 50, 361-376 (1981) 36. Yalcin, Seda Karasu and Z. Yesim Ozbas. 2008. Effects of pH and temperature on growth and glycerol production kinetics of two indigenous wine strains of Saccharomyces cerevisiae from Turkey. Braz. J. Microbiol.  vol.39 no.2 .