ANALISIS KARBOHIDRAT dan SERAT MAKANAN Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers ANALISIS KARBOHIDRAT KH adalah polihidroksi ALDEHID atau polihidroksi KETONE atau kalau dihidrolisis menghasilkan salah satu atau keduanya (polihidroksi aldehid dan atau polihidroksi keton) Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Klasifikasi karbohidrat: Monosakarida: suatu molekul yang terdiri dari lima atau enam atom C. Oligosakarida: polimer dari 2-10 monosakarida. Polisakarida: polimer >10 monosakarida. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Karena struktur monosakarida hydroxyaldehida atau ketone terbuka maka monosakarida sangat reaktif. Monosakarida maupun oligosakarida dengan demikian mudah mengalami ENOLISASI sehingga dapat mereduksi Cu2+ dan Fe(CN)63- GULA PEREDUKSI. Polisakarida (KH) bila dihidrolisis akan menghasilkan: MONOSAKARIDA HIDROKSI ALDEHIDE HIDROKSI KETONE Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Dalam proksimat analisis: Total KH selalu dihitung dengan % BY DIFFERENCE % KH = 100% - (%Air + %Abu + %Lemak + %Protein) Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Kandungan KH pada beberapa jenis bahan pangan: % KH (wet base) Yoghurt Susu Starch (Potato) Potato Carrot Brocolli Tomato Apple Grape Orange Honey Beer 5.60 4.78 83.10 15.40 3.59 2.30 3.63 12.39 16.11 9.19 75.10 2.90 Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Untuk analisis gula dapat digunakan berbagai metode: Metode Reduksi: (a). LANE-EYNON (b). MUNSEN-WALKER (c). NELSON-SOMOGYI (d). ALKALINE-FERRICYANIDE (e). PHENOL-SULFURIC (f). ANTHRONE (g). COLORIMETRY Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Untuk analisis gula dapat digunakan berbagai metode: Polarimetri Densimetri Refraktometri Lain-lain (Enzimatik, Kromatografi, Instrument). Metode FISIK Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers METODE REDUKSI Prinsip gula mengandung ALDEHIDE atau KETONE: Mudah dioksidasi Mampu mereduksi gugus lain Gula pereduksi + Cu++ Cu+ + asam Cu2O + Asam (merah bata) RCHO + 2 Cu(OH)2 R-COOH + Cu2O + 2H2O Gula teroksidasi Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers METODE REDUKSI Analisis dengan: Gravimetri Titrasi/Volumetri Spektrofotometri Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Persiapan sampel: Sampel dalam bentuk cair dibuat basa + CaCO3 agar asam-asam yang terdapat dalam sampel tidak menghidrolisis gula yang ada selama pemanasan. Pemanasan menginaktivasi enzim-enzim penghidrolisa gula. Untuk menghilangkan pigmen, SENYAWA BERWARNA dan SENYAWA KOLOID + Pb-asetat basa. Kelebihan Pb-asetat dihilangkan dengan penambahan Na/K-OKSALAT Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Persiapan sampel: Jika sampel berbentuk padat, perlu dilakukan ekstraksi dengan alcohol 80 % untuk mengekstrak gula yang ada disampel. Kebanyakan gula sensitive terhadap alcohol dengan konsentrasi tinggi alkohol perlu dihilangkan dengan pemanasan rendah. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

METODE NELSON-SOMOGYI adalah modifikasi dari Metode MUNSON-WALKER Prinsip: Reaksi antara Cu2O dengan Arseno-molybdate (Ammonium molybdate = ((NH4)6Mo7O24) + Sodium Arsenate Na2HAsO7 didalam H2SO4. Menghasilkan warna biru, ukur λ 500-520 nm. Pereaksi: (i) Pereaksi tembaga sulfat (ii) Pereaksi arsenomolibdat (iii) Larutan glukosa standar Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

METODE FERISIANIDA BASA Prinsip : Pada pH>10.5, gula akan mereduksi FERISIANIDA FEROSIANIDA yang akan bereaksi dengan ion feri membentuk senyawa biru Prussian yang dapat diukur intensitasnya λ 700 nm. Pereaksi: Larutan Sianida basa Larutan Pottasium ferisianida 0.05% (w/v) dalam air Larutan feriamonium sulfat. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers PHENOL SULFURIC ACID Metode ini: - sederhana - cepat Universal Untuk total KH dalam pangan baik untuk gula pereduksi dan non- pereduksi Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Prinsip: Reaksi KH dengan phenol dalam keadaan asam kuat, menghasilkan panas, diikuti pemanasan 25-30oC selama 20 menit Terjadi dehidrasi KH sehingga terbentuk FURFURAL dan HYDROXYMETHYL FURFURAL, produk ini berkondensasi dengan PHENOL muncul warna YELLOW- ORANGE λ 480 nm = PENTOSE λ 490 NM = HEXOSE Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Metode VOLUMETRIK (MUNSON- WALKER) Titrasi Cuprouse oxide dengan permanganate: Cu2O + Fe2(SO4)3 2FeSO4 + CuSO4 +CuO 10FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O Konversi CuO terhadap gula dapat dilihat dari tabel. Metode ini kurang sensitive (> 5mg glukosa/5ml). Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

THIOSULFAT (Volumetrik) 3Cu2O + 2HNO3 6CuO + 2NO + H2O CuO + 2HNO3 Cu(NO3)2 + H2O 2Cu(NO3)2 + 4KI 2CuI + I2 + KNO3 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 Amylum (Titik akhir warna biru hilang) Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

LANE-EYNON (Volumetrik) Biasanya digunakan untuk penentuan LAKTOSA (anhidrat atau monohidrat) GLUKOSA, FRUKTOSA, MALTOSA (anhidrat atau monohidrat). Penetapan gula pereduksi dengan metode ini didasarkan atas pengukuran volume larutan gula pereduksi standar yang dibutuhkan untuk mereduksi pereduksi tembaga basa yang diketahui volumenya. Titik akhir titrasi ditunjukkan dengan Metilen Biru yang warnanya akan hilang, karena kelbihan gula pereduksi diatas jumlah yang dibutuhkan untuk mereduksi semua tembaga. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Pereduksi: (i) Larutan tembaga sulfat (ii) Larutan tartrat basa (iii) Larutan Fehling (iv) Larutan Dekstrosa standar (v) Larutan Metilen Blue 0,2% dalam air Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers COLORIMETRI Gula pereduksi bereaksi dengan 2.3.5 Triphenyl Tetrazolium Bromide atau Chloride > pH 12.5 yang menghasilkan warna kompleks TRIPHENYL FORMAZON (Pink-Violet-Blue) λ 485 nm. Gula pereduksi bereaksi dengan 3.5-Dinitrosalicylate dalam keadaan basa menghasilkan warna Red-Brown. Karbohidrat dapat bereaksi dengan Resorcinol warna kompleks Karbohidrat dapat bereaksi dengan Orcinol warna kompleks Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

METODE SHAFFER-SOMOGYI Segala jenis bahan pangan terutama yang mengandung sedikit gula pereduksi Prinsip: Gula pereduksi akan mereduksi Cu2+ Cu+ Cu+ dioksidasi oleh I2 (hasil oksidasi KI oleh KIO3 dalam asam) Cu2+ kembali Kelebihan I2 dititrasi dengan Na2S2O3 Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Pereaksi: (1) Larutan Tembaga sulfat (2) Larutan Kalium Iodat 0.1 N (3) Pereaksi Shaffer-Somogyi (4) Larutan Iodida-kalium oksalat (5) Larutan Natrium tiosulfat standar (6) Larutan asam sulfat (7) Larutan pati untuk indikator Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers METODE ANTHRONE Prinsip: Anthrone (9,10-dihydro-9-oxanthra-cene) merupakan hasil reduksi anthraquinone Anthrone bereaksi secara spesifik dengan KH dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna biru kehijauan khas Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

METODE CLEG-ANTHRONE untuk TOTAL AVAILABLE CARBOHYDRATE Prinsip: Bahan di-digest dengan menggunakan asam perklorat, pati yang terhidrolisa bersama-sama dengan gula yang larut dapat bereaksi dengan anthrone membentuk warna biru kehijauan dan dapat ditentukan jumlahnya secara kolorimetrik (dinyatakan sebagai persen glukosa). Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers METODE DNS Prinsip: Dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi 3,5-dinitrosolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur absorbannya pada λ 550nm Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers METODE ENZIMATIS Metode D-Sorbitol Metode Lactose-D-galactose Lactose β-galactose D-Galactose + D-Glucose D-Galactose β-galactose Dehydrogenase D-Galactonic acid + NADH + H+ NADH diukur pada 334, 340 atau 365 nm. Metode Maltose/Sucrose/D-glucose Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Metode Raffinose Raffinose + H2O α-galactosidase D-galactose + Sucrose D-galactose + NAD+ galactose dehydrogenase Galactonolactone + NADH + H+ Raffinose + H2O β-fruktosidase D-fructose + Melibiose Diuji dengan metode lain Metode Oksidasi Karbohidrat + O2 oxidase Oxidized Carbohydrate + H2O2 Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers PENETAPAN SERAT KASAR Serat kasar merupakan residu dalam bahan makanan atau pertanian setelah diperlakukan dengan asam dan alkali mendidih dan terdiri dari sellulosa dengan sedikit lignin dan pentosan. Pereaksi: (1). Antifoam Agent (2). Asbes (3). Larutan H2SO4 (4). NaOH (5). Larutan K2SO4 (6). Alkohol Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

PENETAPAN DIETERY FIBER Bagian dari komponen bahan pangan nabati yang tidak dapat dicerna oleh saluran pencernaan manusia. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Berdasarkan fungsinya dalam tanaman DF dibagi menjadi 3 fraksi utama: POLISAKARIDA STRUKTURAL: terdapat dalam dinding sel dan terdiri dari selulosa dan polisakarida non-selulosa (hemiselulosa dan substansi pektat). NON POLISAKARIDA STRUKTURAL: lignin. POLISAKARIDA NON STRUKTURAL: termasuk gum dan mucilage serta polisakarida lain seperti karagenan dan agar. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

METODE VAN SOEST dan modifikasinya Masih banyak digunakan (mudah dan relatif cepat). Kadar ADF (Acid Detergent Fiber) Kadar NDF (Neutral Detergent Fiber) Penetapan komponen dietery fiber lainnya dapat ditentukan dengan metode lain. METODE KLASON Penetapan lignin METODE SPEKTROFOTOMETRI Substansi pelarut Kadar Hemiselulosa selisih Kadar NDF dengan ADF Kadar Selulosa selisih kadar NDF dengan lignin Total DF Kadar NDF + Substansi Pektat. Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers PENETAPAN ADF Prinsip: Sampel diekstrak dengan larutan ADF (Setiltrimetil ammonium bromide dalam H2SO4 1 N) sehingga seluruh komponen selain komponen ADF larut. Komponen yang tidak larut disaring, dikeringkan, ditimbang, dan dikoreksi dengan kandungan mineral yang ada dalam komponen tersebut dengan cara menyabunkan sehingga yang tinggal hanya mineral saja. Pereaksi: Larutan ADF (20 g setil trimetil ammonium bromide dalam 1 lt H2SO4 1 N) Aseton Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers PENETAPAN NDF Prinsip: Sampel diekstrak dengan larutan NDF sehingga seluruh komponen selain komponen NDF larut. Komponen yang tidak larut disaring, dikeringkan, ditimbang dan dikoreksi dengan kandungan mineral. Untuk sampel yang mengandung pati, maka patinya harus dihidrolisa dengan enzim α-amilose, jika tidak pati tersebut akan menyulitkan dalam pengeringan. Pereaksi: Larutan NDF (18,61 g EDTA-2Na, 6.81 g Na2B4O7.10H2O, 30 g Sodium Lauril Sulfat, 4.56 g Na2HPO4 dan 10 ml 2-etoksi-etanol dilarutkan sampai 1 liter sehingga pH 6,4-7,1). 2. Larutan α-amilase (1 g α-amilase dimasukkan dalam 1 liter buffer phospat). 3. Aseton Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers PENETAPAN LIGNIN Prinsip: Mula-mula sampel diekstrak dengan larutan ADF sehingga seluruh komponen selain selulosa dan lignin larut. Selulosa yang ada dalam residu diihidrolisa dengan H2SO4 72% sehingga yang tertinggal hanya residu lignin. Pereaksi: (1). Larutan ADF (2). Larutan H2SO4 72% (w/v) (3). Aseton Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

PENETAPAN SUBSTANSI PEKTAT (a). Metode Kolorimetrik Mc. Cready dan Mc Comb (1952) yang dimodifikasi oleh Blumenkrentz-dan Arboc Hansen (1973). Penetapannya didasarkan pada reaksi antara o-hidroksidifenil dengan anhidrogalakturonat yang menghasilkan warna dan diukur pada λ 520 nm. Pereaksi: Larutan versen 0.5% Larutan tetraborat dalam sulfat Larutan o- hidroksidifenil NaOH 0.05N Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers (b). Metode Gravimetrik Pektin yang telah diekstrak disaponifikasi dengan alkali dan diendapkan sebagai kalium pektat dengan penambahan kalsium klorida dalam suasana asam. Endapan kalsium pektat dicuci sampai bebas klorida, dikeringkan dan ditimbang. Pereaksi: Asam asetat 1N Kalsium klorida 1N Perak nitrat 1% HCl 0.05N Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers Duplicate sample 2 g (wet sample) Dissolved in 30 mL water Boiled for 5 min Cooled to room temperature 30 ml of 1/15 mol phosphate buffer (pH 6.8) 20 ml of 2% pancreatin NaCl to make conc. of 10 mM 2 - 3 drops of toluene Incubated at 37oC for 24 h Centrifuged at 6,000 rpm, 10 min, 5oC Filter (ADVANTEC TOYO; GLASS FIBER GA-100) Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Filter (ADVANTEC TOYO; GLASS FIBER GA-100) Residue Filtrate 4 vol of ethanol (60oC) Precipitation stand for 60 min Filter (ADVANTEC TOYO; GLASS FIBER GA-100) Washed Washed 78% ethanol, 20 mL x 3 95% ethanol, 20 mL x 2 acetone, 10 mL x 2 78% ethanol, 20 mL x 3 95% ethanol, 20 mL x 2 acetone, 10 mL x 2 Dried (105oC, overnight) Dried (105oC, overnight) Cooled and weighed Cooled and weighed Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Calculated (insoluble and soluble dietary fibers) Protein determination Ash determination Calculated (insoluble and soluble dietary fibers) Determination of dietary fiber by modified AOAC method Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers

Carbohydrate and Dietary Fibers TERIMA KASIH Copyright Dr. Joko Santoso Carbohydrate and Dietary Fibers