Puti Sri Komala 35306001 Qomarudin Helmy 35306002 PENTARGETAN SPESIFIK VIRUS HEPATITIS C NS3 RNA HELICASE PENEMUAN INHIBITOR PEMIMIKAN NUKLEOTIDA QU663 YANG BERPOTENSI DAN SELEKTIF KOMPETITIF Puti Sri Komala 35306001 Qomarudin Helmy 35306002

Pendahuluan Infeksi virus hepatitis C (HCV) masalah kesehatan serius yang diderita  170 juta penduduk seluruh dunia. Satu-satunya terapi HCV → INF, sendiri maupun kombinasi dengan nukleotida analog ribavirin → sukses 50%, beberapa efek samping Alternatif obat → berinteraksi secara selektif dengan enzim komplex replikasi virus, menghambat pertumbuhan virus dengan sedikit atau tanpa toksisitas pada sel host yang tak terinfeksi.

Pendahuluan Penyebab hepatitis C adalah virus HCV→ protein nonstruktural (NS) adalah proteases/helicase NS3 → terlibat dalam proses poliprotein virus dan duplikasi genome HCV. NTPase menghidrolisa ribo- dan deoxy-NTP, serta sebagai analog nukleosida triphosphat → energi untuk reaksi pelepasan yang dilakukan oleh helicase Aktivitashelicase NS3 → melepaskan homoduplex DNA-DNA dan RNA-RNA, juga heteroduplex RNA-DNA

Penemuan molekul baru → menghalangi NS3 helicase (NS3h) dan aktivitas NTPase → sasaran binding site non-nukleosida HIV-1 reverse transkriptase (RT) Diidentifikasi QX432 → inhibitor HIV-1 berbasis quinoxaline dan QU663 quinoline → menghambat reaksi helicase secara kompotetitif terhadap substrat NA, tanpa mempengaruhi fungsi ATPase → obat anti-HCV baru

BAHAN DAN METODA Quinoxaline QX432 dan QX449; quinoline QU494 dan QU663 (Grafik 1) Persiapan Substrat Asam Nukleat Pembuatan susbtrat DNA 5'-end-labeled sp d18:d66-mer Purifikasi Protein Escherichia coli DH5 dikotransformasikan dengan plasmid berlabel NS3 → diinokulasi, disentrifugasi → lisis sel, lysate di sentrifugasi NS3 dimurnikan dari supernatant dengan khromatografi Percobaan ATPase Monitoring langsung hidrolisis [-32P]ATP dengan thin layer chromatography

Percobaan Helicase Larutan: 200 nM NS3, 5 mM Tris HCL (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 25 nM substrat DNA duplex yang berlabel 32P dan 5 mM ATP diinkubasi, reaksi dihentikan buffer → dianalisa pada gel polyacrylamide Sampel-sampel tanpa substrat NA diukur spektrofotometer Percobaan absorbance quenching : 50 mM Tris HCL (ph 7,5), 5 mM MgCl, QU663 dan NA (panjang fragment rata-rata DNA 250 bp) Konst QU663 meningkat dan konst QU663 tinggi Untuk mengetahui QU663 berikatan dengan DNA

Grafik 1 Quinoxaline QX432 dan QX449; quinoline QU494 dan QU663

BAHAN DAN METODA Percobaan Electrophoretic Mobility Shift Larutan: 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, QU663 dan substrat DNA (p TrC plasmid, 4,4 kb, InvitroGen), diinkubasi, reaksi dihentikan buffer, dirun pada gel agarose 0,75% dengan dan tanpa EtBr. Percobaan Inhibisi dan Penentuan Konstanta Kinetika Percobaan inhibisi pada aktivitas ATPase dan helicase → peningkatan jumlah inhibitor (10, 20, 50, 100, 200 dan 500 μM) dan konsentrasi substrat DNA (33, 66,dan 333 nM) → berdasarkan waktu Data dianalisis sesuai persamaaan eksponensial Dimana A amplitudo burst, k1 konstanta laju orde pertama apparent pada asosiasi enzim dengan substratnya (burst rate) dan t waktu Laju katalitik apparent reaksi dan afinitas enzim untuk substrat NA (KNA) :

BAHAN DAN METODA Kurva dose-response → model Hill, perhitungan pengikatan NS3 ke sustrat DNA. ID50 (konsentrasi inhibitor → inhibisi 50%) Dimana k adalah laju reaksi dengan adanya konsentrasi inhibitor(I), laju reaksi tanpa inhibitor, dan n index kooperasi.

Karena konsentrasi enzim tinggi (sesuai konsentrasi substrat DNA) → tidak diabaikan, Ki diturunkan dari ID50 → persamaan Cheng-Prusoff untuk inhibitor kompetitif. Nilai ID50 dirubah menjadi nilai Ki, Dimana [E] adalah konsentrasi enzim total, Kd konstanta disosiasi untuk pengikatan DNA dan n index kooperativitas Pemodelan Molekuler Percobaan inhibisi HIV-1 RT, Test Anti-HIV sekunder (Percobaan Kultur Sel) dan uji toksisitas.

Hasil dan Pembahasan QU663 merupakan Inhibitor spesifik dari aktifitas Protein HCV NS3 (virus Hepatitis C) QU663 berkemampuan untuk menghambat NTPase dan aktifitas Helicase dari NS3 (enzim yang bertanggung jawab dalam pembentukan polyprotein virus serta duplikasi dari gen HCV)

Adanya radioaktif ATP (Lane 1 dan 2). Hasil kromatogram dari reaksi ATPase dengan absennya radioaktif ATP (Lane 3) Adanya radioaktif ATP (Lane 1 dan 2). Indikasi dari substrat/ATP adalah spot hitam di bawah, Indikasi produk adalah spot hitam diatas

Dari Gambar 1A, jelas terlihat bahwa QU663 tidak mampu menghambat aktifitas dari NS3 ATPase, meski dalam konsentrasi yang tinggi (500 µM)

Denaturing polyacrylamide gel electrophoretic analysis dari produk pada Helicase assay dengan kenaikan konsentrasi QU663. Lane 7 = reaksi tanpa enzim Lane 8 = campuran media dididihkan

Gambar 1B menunjukkan reaksi pada helicase assay Terlihat bahwa QU663 menghambat aktifitas helicase dari NS3 pada konsentrasi 100 µM.

QU663 adalah inhibitor competitif dari NS3h dengan NA sebagai substrat QU663 menghambat aktifitas NS3 tanpa mempengaruhi kemampuannya menghidrolisa ATP (Gambar 1) Hepotesa yang diajukan= QU663 menghambat NS3 dalam utilisasi substrat NA, seperti ditunjukkan dalam Gambar 2 berikut:

Dengan penambahan substrat NA sebesar 66 nM terjadi peningkatan nilai absorbansi seiring dengan perubahan waktu (reaksi terjadi). Namun nilai absorbansi menurun seiring dengan kenaikan konsentrasi QU663 QU663 = competitive Inhibitor

Laju reaksi k’ menurun seiring dengan kenaikan konsentrasi QU663

Plot antara laju reaksi k’ sebagai fungsi atas konsentrasi substrat (NA). KNA =0.18 µM (- QU663/tanpa inhibitor) KNA =0.7 µM ( + 100 µM QU663)

Nilai konstanta inhibitor Ki dari hasil percobaan

QU663 tidak mengubah struktur DNA Untuk mengetahui apakah QU663 berinteraksi dengan DNA atau tidak, dilakukan dengan 2 metoda : Absorbansi dan electrophoretic

QU663 mempunyai 2 puncak absorban, ג1= 314 nm dan ג2= 390 nm

Ketika QU663 dicampur pada 3 variasi DNA tidak menunjukkan percampuran/interfensi pada kedua puncak absorbansi QU663 (Gambar 3B)

Tidak ada perbedaan pada peta DNA ketika QU663 dicampur dengan DNA plasmid (lane 2,3,4) Lane 1= QU663, lane M= molecular size marker

Gambar keseluruhan komplek QU663-NS3. Terlihat QU663 menempel pada binding site NS3

Kesimpulan QU663 adalah inhibitor competitif selektif terhadap reaksi helicase dari HCV NS3 (Ki =0.75M) QU663 menghambat utilisasi HCV terhadap substrat NA tanpa mempengaruhi fungsi ATPase. QU663 berpotensi untuk obat anti HCV baru.

TERIMA KASIH Artikel asli: Specific Targeting of Hepatitis C Virus NS3 RNA Helicase. Discovery of thePotent and Selective Competitive Nucleotide-Mimicking Inhibitor QU663† (By: Giovanni Maga,‡,§ Sandra Gemma,§,| Caterina Fattorusso,§,^ Giada A. Locatelli,‡,§ Stefania Butini,§,| Marco Persico,§,^ Gagan Kukreja,§,| Maria Pia Romano,§,| Luisa Chiasserini,§,| Luisa Savini,§,| Ettore Novellino,§,^Vito Nacci,§,| Silvio Spadari,‡,§ and Giuseppe Campiani*,§,|) Journal Biochemistry 2005, 44, 9637-9644