PROSES HILIR (Downstream Process) m. k. DASAR TEKNOLOGI MIKROBIAL TIN 232/1 (2-0) PROSES HILIR (Downstream Process) Dosen : Liesbetini Hartoto DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FATETA IPB 2011

Penanganan/pembuangan RANAH PROSES HILIR PROSES HULU Bahan baku Persiapan bahan Fermentasi Sterilisasi PROSES HILIR Penanganan/pembuangan Residu residu ‘broth’ Pemisahan filtrat Isolasi produk biomassa Penanganan/ pembuangan biomassa Pembuangan/daur ulang (recycle) Pemanfaatan/pembuangan Downstream – ‘after the fermentation process’

DIAGRAM ALIR BIOPROSES Substrat Analisis Pendahuluan Pengaturan pH Penambahan garam mineral, Sumber C dan N dll H2O Teknologi Pencampuran Persiapan media fermentasi Inokulum Sterilisasi Energi Aerasi Pengukuran & pengontrolan Fermentasi CO2 dan gas lain Panas

Pemisahan Biomassa dan cairan kultur Purifikasi Produk & Formulasi Isolasi Produk Purifikasi Produk & Formulasi Produk Akhir Biomassa Residu Fermentasi Residu Fermentasi Pembuangan Residu

Proses hilir : sulit perlu teknik yang tepat dan biaya tinggi 20 – 60 % total biaya produksi Cara menurunkan biaya : Meningkatkan konsentrasi produk yg dihasilkan - teknologi kultivasi - rekayasa genetika 2. Proses hilir dibuat lebih efisien

KRITERIA PEMILIHAN METODE PROSES HILIR Lokasi produk (intra/ekstraseluler) Konsentrasi produk dalam cairan kultivasi (‘broth’) Sifat-sifat kimia dan fisik produk (ukuran partikel, kelarutan, densitas, difusifitas, muatan dll) Penggunaan produk  pangan, farmasi dll Standar tingkat kemurnian minimal yang ditentukan Adanya senyawa pengotor (mis. pigmen) dalam cairan kultivasi Harga jual produk

KARAKTERISTIK BIO-PRODUK 1.Konsentrasi rendah dan campuran kompleks (sel, komponen medium & produk metabolik) Konsentrasi (g/l) - PST 30-50 - Etanol 70-120 - Camp.aseton/butil alkohol/etanol 18-20 - Asam organik 40-100 - Antibiotika (Penisilin G) 10-30 - Enzim 2 -5 - Vitamin B-12 0.02 - Riboflavin 10-15 2. Lokasi Produk (intraseluler/ekstraseluler) 3. Labil/sensitif thd pH, suhu, kekuatan ion dll

4. Tidak stabil  pH, suhu, kekuatan ion, jenis pelarut yang digunakan, dirusak mikroba kontaminan dll dapat dihindari dengan pendinginan ±5oC tapi biayanya tinggi 5. Gravitas Spesifik partikel hampir sama / kental  menyulitkan sentrifugasi / presipitasi 6. Sel m.o ‘compressible’ (dapat dimampatkan & lengket)  menyulitkan filtrasi karena terbentuk kerak

TAHAPAN UMUM PROSES HILIR Cairan Kultivasi/Fermentasi Pemisahan sel m.o/ partikel tidak larut (filtrasi, sentrifugasi, sedimentasi) 2. Isolasi primer isolasi produk dari cairan kultivasi  pemekatan ( belum murni) (ekstraksi dengan pelarut, presipitasi, ultrafiltrasi) 3. Purifikasi penghilangan, kontaminan (‘fractional presipitation’, khromatografi) 4. Isolasi produk tahap akhir sesuai formulasi/ aplikasi akhir atau distribusi/transportasi = ‘Polishing’  ‘drum/spray drying, pengeringan beku (freeze drying), kristalisasi

MODIFIKASI PENANGANAN CAIRAN KULTIVASI (‘broth’)  Pretreatment Seleksi m.o yang tidak memproduksi pigmen atau metabolit yang tak diinginkan Modifikasi kondisi kultivasi untuk mengurangi produksi metabolit yang tidak diinginkan Waktu pemanenan yang tepat Pengontrolan pH setelah pemanenan (bufer) 5. Pengaturan suhu setelah pemanenan (pendinginan) 6. Penambahan ‘flocculating agent’ (flokulan) u/ koloid (polisakarida) 7. Produk intraseluler  penggunaan enzim yang dapat menghidrolisis dinding sel m.o  penanganan lebih cepat Hasil : Peralatan proses hilir lebih sederhana

Pemilihan proses hilir harus tepat PROSES HILIR IDEAL Diperoleh produk berkualitas tinggi Proses cepat & efisien Investasi peralatan tidak mahal Biaya operasi rendah Pemilihan proses hilir harus tepat

KLASIFIKASI METODE PEMISAHAN Prinsip pemisahan Metode pemisahan Ukuran partikel (μm) Ukuran partikel Fiberfiltrasi Mikrofiltrasi > 200 – 10 20 – 0.5 Ukuran molekul Ultrafiltrasi Hiperfiltrasi Gel Khroma-tografi Dialisis 2 – 0.005 0.008 – 0.00025 2 – 0.0003 0.002 – 0.00025 Suhu Kristalisasi < 0.0002

KLASIFIKASI METODE PEMISAHAN Prinsip pemisahan Metode pemisahan Ukuran partikel (μm) Kelarutan Adsorbsi Ekstraksi < 0.002 Muatan listrik Elektroforesis Elektrodialisis Pertukaran ion 2 – 0.02 0.02 – 0.00025 Bobot jenis (densitas) Sedimentasi Dekantasi Sentrifugasi Ultra sentrifugasi > 1000 1000 – 5 1000 – 0.5

FILTRASI Pemisahan partikel tersuspensi dari cairan/gas Menggunakan medium filter berpori yang menahan partikel (=retentat), tetapi melewatkan cairan/gas (=filtrat) Proses umum untuk semua skala operasi ……………. slurry ‘Filter cake’ - - - - - - - - - filter filtrat

Rotary Vacuum Drum Filter PERALATAN FILTRASI Rotary Vacuum Drum Filter - drum bersekat yang dilapisi filter kain/logam  dimasukkan tangki cairan kultivasi (bagian yg terendam ± 35%) - filter dilapisi ‘filter aid’ (contoh : tanah diatomeae) - kecepatan berputar 0.1-10 rotasi/menit - vakum dijalankan melalui pipa drainasi - filtrat terkumpul melalui pipa di bag dalam drum Produk Umpan Filtrat

Rotary Vacuum Drum Filter PERALATAN FILTRASI Rotary Vacuum Drum Filter - ‘filter cake’ (kerak) dipotong dengan pisau  produk - penggunaan : * enzim ekstraseluler * sel khamir & kapang dll  untuk volume besar & proses sinambung

2. Leaf Filter - dapat dioperasikan seperti “vacuum/presure filter” - selama filtrasi tidak diputar  akhir filtrasi diputar untuk pembuangan padatan - ‘Filter aid’ (tanah diatomeae dll) ditambah pada umpan - dapat digunakan secara tertutup

Leaf Filter

3. Filter Press - ‘plate’ & ‘frame’ berseri  tiap ‘plate’ dilapisi filter  sederhana dan murah - ‘Broth’ ditekan dg tekanan (± 20 bar)  padatan tertahan di bag dlm bejana & filtrat dikeluarkan melalui saluran pada permukaan ‘plate’ - digunakan untuk suspensi yang sulit di-filter (kental) - tidak memerlukan ‘filter aid’ - operasi batch (curah) - waktu penghilangan ‘cake’ pembersihan & pemasangan alat lebih lama

Filter Plate Filter Press

SENTRIFUGASI Diperlukan bila : Pemisahan dgn filtrasi sulit (perbedaan densitas sel & produk kecil) dan mahal Sel dan bahan tersuspensi lain harus bebas dari ‘filter aid’ Diperlukan pemisahan dgn standar higiene tinggi Dasar pemikiran : Pemisahan berdasarkan perbedaan densitas antara padatan dan cairan & ukuran partikel dan viskositas cairan medium yang dipercepat dgn gaya sentrifugal Partikel padatan mengalami akselerasi (percepatan) yang berbeda

Centrifus : peralatan yang digerakkan dengan motor  contoh berotasi sekitar sumbu, menggunakan gaya yang tegak lurus thd sumbu. Prinsip kerja alat : sedimentasi (Hukum Stokes)  pemisahan partikel bahan berdasarkan perbedaan densitas Faktor yg mempengaruhi laju sedimentasi : * perbedaan densitas antara sel dgn cairan * diameter sel * viskositas cairan Sentrifus “batch” kapasitasnya terbatas  tidak cocok untuk skala besar Sentrifus yg digunakan untuk pemisahan sel biasanya dioperasikan secara sinambung atau semi sinambung

Centrifugation properties of different cell types High speed required Low cell damage Lower speed required High water retention in pellet Very susceptible to damage Bacteria Small cell size Resilient Yeast cells Large cells Filamentous fungi Mycelial Cultured animal cells Very fragile

Cara mempercepat sendimentasi (pembentukan flokulan) : Pendinginan  khamir bir Perubahan pH  netralisasi muatan anion sel Penambahan bahan kimia :  garam Al, Ca, Fe, tannic acid, TiCl4, senyawa kationik (senyawa amonium)

Industrial centrifuges bowls, motor drives, cooling jackets & sludge collection vessels Tubular bowl Chamber Disc Faktor akselerasi Tubular centrifuge 13000 – 17000 g Chamber centrifuge 6000 – 11000 g Disc-stack centrifuge 5000 – 15000 g

Properties of industrial centrifuges Limited solids capacity Foams Difficult to recover protein No solids discharge Cleaning difficult Solids recovery difficult Poor dewatering Difficult to clean Tubular - High centrifugal force Good dewatering Easy to clean Chamber Large solids capacity Bowl cooling possible Disc type Solids discharge No foaming

ISOLASI PRODUK ekstraseluler  langsung diekstraksi Produk intraseluler  pemecahan sel 1. Metode fisika-mekanika - liquid shear (high-pressure homogenizer) - solid shear (ekstrusi dg tekanan pd sel mo beku (-250C) - pengadukan dg ‘abrasives’ (glass ballotini) - pembekuan & pencairan (kristal es merusak sel) 2. Metode Kimia - Deterjen (e.g. sodium lauril sufat, Tween, Triton X-100) - Kejutan osmotik (perubahan mendadak kons. garam) - Perlakuan dengan alkali (untuk enzim yg tahan alkali) - Perlakuan dengan enzim (e.g lysozime) kondisi ‘lunak’ tapi mahal & purifikasi kompleks

Cell disruption (for intracellular enzymes) Sonication Use of high frequency sound waves to disrupt cell walls and membranes Can be used as continuous lysis method Better suited to small (lab-scale) operations Can damage sensitive proteins Pressure cells Apply high pressure to cells; cells fracture as pressure is abruptly released Readily adapted to large-scale and continuous operations Industry standard (Manton-Gaulin cell disruptor) Enzymic lysis Certain enzymes lyse cell walls Lysozyme for bacteria; chitinase for fungi Only useful on small laboratory scale

1. Ekstraksi Cairan-cairan ISOLASI PRODUK 1. Ekstraksi Cairan-cairan Pemisahan komponen suatu cairan dengan penggunaan pelarut yang dapat melarutkan komponen tersebut Penentuan jenis pelarut  nilai koefisien partisi atau distribusi (K) K = Konsentrasi solut dalam ekstrak Konsentrasi solut dalam rafinat K > 0.5  pemisahan lebih mudah  ekstraksi 1 tahap K < 0.1  Ekstraksi bertahap : - ‘Concurrent’ (aliran searah) - ‘Counter Current’ (aliran berlawanan arah)  lebih efisien

Peralatan Ekstraksi dgn Pelarut : Skala Kecil (Lab) : separating funnel Skala Industri : centrifugal contactors, spray columns, pulsed columns dan mixer-settlers. Mixer-settler

ISOLASI PRODUK Destilasi Untuk pengambilan cairan/pelarut (produk kultivasi, e.g etanol, aseton, butanol dll ) Tahapan : Evaporasi  pemisahan pelarut dari cairan kultivasi Pemisahan uap cairan untuk memisahkan pelarut yang lebih volatil dan kurang volatil Kondensasi uap untuk mendapatkan pelarut kembali

ISOLASI PRODUK 3. Khromatografi  Isolasi & pemurnian metabolit dengan konsentrasi rendah a. Khromatografi Adsorbsi  contoh : untuk antibiotika streptomisin Adsorbsi senyawa oleh fase padat (absorban). Pemisahan terjadi karena setiap senyawa diadsorbsi dengan kekuatan berbeda-beda  senyawa yang diikat paling kuat akan dielusi paling akhir Contoh absorban : karbon aktif, Mg oksida, Al oksida, Al (OH)3, silikat gel

b. Khromatografi Penukar Ion  contoh : untuk antibiotika Pertukaran antara ion pada fase cair dan fase padat yang reversible tanpa mengubah strukturnya Fase padat  resin penukar ion Contoh : R-COO’Na+ + streptomycin  R-COO’streptomicin+ + NaOH (resin) (resin) R-COO’streptomicin+ + HCl  R-COOH + streptomicin+Cl’ (resin) (resin) Regenerasi Resin : R-COOH + NaOH R-COO’Na+ + H2O

c. Khromatografi Filtrasi Gel  contoh : untuk vaksin Pemisahan berdasarkan atas ukuran molekul. Mol kecil berdifusi ke dalam gel lebih cepat, sehingga dielusi paling akhir d. Khromatografi Afinitas  contoh : untuk enzim - Pemisahan berdasarkan struktur kimia atau fungsinya  interaksi spesifik antara pasangan molekul-molekul biologis : a. enzim - substrat b. enzim - inhibitor c. antigen - antibodi

POLISHING (Penyelesaian) KRISTALISASI  pemisahan padatan dari larutan (teknik pemurnian senyawa padatan) - Prinsip : pembentukan padatan kristal dari larutan lewat jenuh (supersaturated) Contoh : Produksi asam sitrat Produksi asam amino ( asam glutamat, lisin) Produksi asam MSG

crystallizer type (Swenson Draft tube) Widely used crystallizer type (Swenson Draft tube) http://www.tkk.fi/Units/ChemEng/research/Crystallization/SwenDTB.gif

PENGERINGAN Agar memudahkan penanganan dan pengangkutan  harus dijaga viabilitas, aktivitas & nilai gizi produk Sebelum pengeringan  dapat disentrifugasi/filtrasi kadar air produk berkurang, sehingga pengeringan lebih cepat “Spray drying” Cara pengeringan cairan menggunakan udara panas  cairan dipompa melalui ‘atomizer’, sehingga dihasilkan tetesan halus ke dalam bejana pengering  powder

Spray drying :http://class.fst.ohio-state.edu/.../14Spraydrying.htm

Contoh : Proses Hilir Ragi Roti Cairan kultivasi S. cerevisiase Centrifugasi Filtrat Pasta Ragi Rotary Vacuum Filter (pengeringan) Tepung Ragi Roti

Proses Hilir Asam Sitrat Cairan kultivasi A. niger Evaporasi Rotary Filter miselium mo Kristalisasi Filtrat + Ca(OH)2 Sentrifugasi Rotary Filter Kalsium sitrat Pengeringan (+) H2SO4 Asam Sitrat Rotary Filter Asam sitrat CaSO4 A

Proses Hilir Penisilin Cairan kultivasi Rotary vacuum Filter Miselia mo Ekstraksi dg centrifugal extractor (pelarut : amil asetat/butil asetat) Evaporasi & Kristalisasi Re-ekstraksi dg air (+buffer) Pengeringan (vacuum Drier) Penisilin

Contoh : Formulasi Enzim Deterjen Protease alkalin dari Bacillus sp Bentuk awal : dry powder  pekerja alergi & gangguan kulit Formulasi :  enkapsulasi : - debu tak beterbangan - partikel larut cepat - tak menghasilkan bau & warna - daya simpan lebih baik, melindungi thd komponen lain contoh pemutih (bleaching agent )

Proses Enkapsulasi Protease Cairan fermentasi (broth)  filtrasi  presipitasi enzim  filtrasi  pengeringan  disaring  powder Formulasi : enzim powder dicampur aditif penstabil etoxylated-C18-fatty alcohol terbentuk bola lalu dilapis (minyak parafin atau PEG) agar tidak berdebu selama penanganan