ALKALOIDA ZAINAB, M.SI., Apt.

ALKALOIDS Ephedra Tree Daturas Opium poppy

ALKALOIDA Senyawa basa nitrogen organik yang terdapat dalam tumbuhan Kebanyakan punya aktivitas biologi tertentu obat. Umumnya mengandung 1 atom N (ergometrin, fisostigmin, kafein > 1 N ). Keberadaan alkaloida : tan.tinggi, tan.rendah, organisme laut, binatang, mo.

-eases motion sickness - reduces nasal congestion ALKALOID Datura stramonium Scopolamine -eases motion sickness Taxus brevifolia Taxol -anticancer Papaver somniferum Morpine, Codeine - eases pain; suppresses coughing Filipendula ulmaria Aspirin - reduces pain & imflammation Ephedra sinica Pseudoephedrine - reduces nasal congestion Cinchona pubescens Quinine -anti-malaria Catharanthus roseus Vinblastine -anti-cancer

SIFAT FISIKA & KIMIA ALKALOID Umumnya berbentuk kristal/padatan dengan TL yang jelas. Kadang amorf atau cairan kental (nikotin, coniine) Umumnya tidak berwarna, kec Berberine (poli aromatik) Alkaloid basa larut dlm pelarut organic Alkaloid garam larut dalam air. Sifat kimia: Basa Sifat kebasaan alkaloid tergantung pd substitusi pada atom N

PYROLIDINE PYROLE PIRIDINA PIPERIDINA ISOQUINOLINE INDOLE QUINOLINE

KLASIFIKASI ALKALOIDA TRUE ALKALOIDA (alkaloida sejati) Toksik Aktivitas fisiologis Berasal dari asam amino Atom N-heterosiklik PROTO ALKALOIDA (alkaloida sederhana) Molekul sederhana, “Biological amines” Basa dan berasal dari asam amino Atom N bukan heterosiklik Histamin, epinerphin, dopamine, serotonin. Mescalin (kaktus) PSEUDO ALKALOIDA (alkaloida semu) Basa, berasal bukan dari asam amino Ada 2 klas : alkaloida steroid dan purin Coffein, conessine

KLASIFIKASI BERDASARKAN PRECURSOR Dari ornithine Dari L-Lysine dari asam nikotinat dari polyacetat dari asam antranilat dari phenylalanine & Tyrosine dari Thryptophan dari histidine dari isoprenoid lain-lain.

CO2 + H2O PRIMARY METABOLISM Photosynthesis Glucose Carbohydrates hn PRIMARY METABOLISM Photosynthesis Glucose Carbohydrates SECONDARY METABOLISM SECONDARY METABOLISM G L Y C O L Y S I S Building Blocks Phenyl- propanoids Amno Acids Fatty Acids Lipids Flavonoids Proteins Alkaloids synthesis enzymes Acetyl CoA regulation Acetogenins Terpenes Steroids Nucleic Acids Citric Acid Cycle reproduction RNA DNA CO2 + H2O + ATP

13.4 A simplified view of the major pathways of secondary-metabolite biosynthesis pp4e-fig-13-04-0.jpg

Plant Tissue Culture

Alkaloida dari Ornithine Punya inti pirolidin Ada 3 group : Alkaloid tropan (atropin, -skopolamin, hyosiamin) Alk. Nikotin : jml sangat kecil Alk. Pyrrolizidin (byk di suku asteraceae).

Atropa belladona Herba: 0,3 – 0,6% alkaloid terdiri atas (-)-hyosiamin, (-)-hyosin Akar: 0,4 – 0,8% alkaloid terdiri atas (-)-hiosiamin, (-)-hyosin, (-)-cuscohigrin

Biosynthetic pathways of tropane alkaloids and nicotine Biosynthetic pathways of tropane alkaloids and nicotine. Tropane alkaloids and nicotine are derived from diamine putrescine produced from ornithine by ornithine decarboxylase (ODC), arginine, or both (28, 29). Putrescine is N-methylated by PMT then oxidatively deaminated by diamine oxidase to the 1-methyl-Δ1-pyrrolinium cation (30). This cation is condensed with a derivative of nicotinic acid, forming nicotine in tobacco, or is further metabolized to tropinone in tropane alkaloid-producing plants. Hygrine is formed nonenzymatically by condensation of the cation and acetoacetic acid (31), but its involvement in alkaloid biosynthesis has not been established. Tropinone is reduced by tropinone reductase I (TR-I) to tropine (22), which condenses with phenyllactic acid or its derivative, giving hyoscyamine. Scopolamine is formed from hyoscyamine via 6β-hydroxyhyoscyamine by the bifunctional enzyme hyoscyamine 6β-hydroxylase (H6H) (32). The nicotinic acid moiety of nicotine is supplied from the pyridine nucleotide cycle, in which quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPT) serves as the entry-point enzyme. Sato F. et.al. PNAS 2001;98:367-372 ©2001 by The National Academy of Sciences

Alkaloida dari Lysine Punya inti piperidin Ada 2 Analog ornithine : Anaferine, Anabasine, Lupinine Berbeda dgn Ornithine Lobeline, Lythrine, Spartein

Piper nigrum

Alkaloid yang berasal dari asam nikotinat Alkaloid piridin

Alkaloida dari poliasetat Ciri punya rantai HK panjang

Alkaloida dari asam antranilat CIRI KHAS

Alkaloida dari Phenylalanin dan tyrosine Paling banyak di alam, tp yang paling banyak diisolasi adalah turunan phenylalanine Feniletilamin CIRI KHAS

Alkaloid yang berasal tirosin Alkaloid fenil etil amin Alkaloid Feniletil isokuinolin

Alkaloid fenil etil amin Katekolamin: Neurotansmiter

Alkaloid Benziltetrahidroisokuinolin Chondrodendron tomentosum

Schematic biosynthetic pathway for a variety of isoquinoline alkaloids Schematic biosynthetic pathway for a variety of isoquinoline alkaloids. 1, l-tyrosine decarboxylase; 2, phenolase; 3, l-tyrosine transaminase; 4, p-hydroxyphenylpyruvate decarboxylase; 5, (S)-norcoclaurine synthase; 6, (S)-adenosyl-l-methionine:norcoclaurine 6OMT; 7, (S)-adenosyl-l-methionine:coclaurine N-methyltransferase; 8, N-methylcoclaurine-4′-hydroxylase; 9, S-adenosyl-l-methionine: 3′-hydroxy-N-methylcoclaurine 4′OMT; 10, berberine bridge enzyme; 11, S-adenosyl-l-methionine:scoulerine 9-O-methyltransferase; 12, (S)-canadine synthase; 13, tetrahydroprotoberberine oxidase; 14, cheilanthifolin synthase. Schematic biosynthetic pathway for a variety of isoquinoline alkaloids. 1, l-tyrosine decarboxylase; 2, phenolase; 3, l-tyrosine transaminase; 4, p-hydroxyphenylpyruvate decarboxylase; 5, (S)-norcoclaurine synthase; 6, (S)-adenosyl-l-methionine:norcoclaurine 6OMT; 7, (S)-adenosyl-l-methionine:coclaurine N-methyltransferase; 8, N-methylcoclaurine-4′-hydroxylase; 9, S-adenosyl-l-methionine: 3′-hydroxy-N-methylcoclaurine 4′OMT; 10, berberine bridge enzyme; 11, S-adenosyl-l-methionine:scoulerine 9-O-methyltransferase; 12, (S)-canadine synthase; 13, tetrahydroprotoberberine oxidase; 14, cheilanthifolin synthase. Sato F. et.al. PNAS 2001;98:367-372 ©2001 by The National Academy of Sciences

Alkaloida dari Tryptophan Indol etil amin CIRI KHAS

Alkaloid yang berasal dari triptofan Alkaloid terpen indol

Rauwolfia serpentina

Catharantus roseus

Alkaloida indol monoterpen

Alkaloida dari histidine

Alkaloid purin

Steroidal alkaloids

Steroidal alkaloids

Alkaloid steroidal

ISOLASI ALKALOIDA Isolasi alkaloida dari simplisia pada umumnya dilakukan dengan cara penyarian menggunakan pelarut organic yang tidak campur air (CHCl3 , eter). Dalam tumbuhan Alkaloida biasanya terikat sebagai garam dengan asam organic. Maka sebelum dilakukan penyarian dengan pelarut organic, alkaloida harus dibebaskan dari ikatan garamnya dgn penambahan basa (alkali). Skrining Alkaloida 1. Ekstraksi dgn air asam ekstrak kasar diuji 2. Agak dimurnikan + basa + pelarut organic yg tak camp. Air 3. + NaCl (salting out) mengendapkan protein.

Pemilihan jenis basa: Sifat kimia alkaloid Contoh alkaloida NaOH X √

Mengapa penggunaan basa kuat NaOH sedapat mungkin dihindari? Adanya lemak atau bahan berlemak Basa kuat tidak dapat digunakan jika alkaloida terdapat dalam bahan berlemak sabun. Alkaloida yang terikat tannin. Alkaloida yang terikat tannin, misalnya alkaloida dalam kulit pomegranat diperlukan NaOH untuk membebaskan alkaloida dari ikatan garamnya. Alkaloida kinin juga terikat oleh tannin, cara isolasinya serbuk kulit kina di + HCl encer atau asam format sehingga terbentuk garam HCl. Selanjutnya dibasakan dgn NaOH untuk memecah garam kinin-HCl menjadi kinin basa dan disari dgn pelarut organic (kloroform).

Serbuk kulit kina + HCl encer Ampas Sari air asam + NaOH 5% + CHCl3 Sari air basa Sari CHCl3 + Na2SO4 anh. (Alkaloid Kinin)

Separation of the Alkaloidal mixtures:

Pemilihan Jenis Pelarut untuk Penyarian alkaloida: Kelarutan alkaloid Factor koefisien partisi yaitu perbandingan kelarutan alkaloida dalam pelarut organic dan dalam air basa.

Sifat dan jumlah senyawa Pelarut harus dipilih sedemikian sehingga zat lain yang tidak dikehendaki sedikit mungkin tersari. Selektifitas Pelarut yang hanya menyari alkaloid tertentu dari campuran alkaloida yang ada. Misal pada isolasi emetin digunakan eter sebagai pelarut karena eter hanya melarutkan emetin dan sefalin, tetapi tidak melarutkan alkaloida psikotrin. Metode penyarian Diantara pelarut organic yang banyak dipakai, CHCl3 mrpk pelarut pilihan. Kelebihan : alkaloida mdh larut dalam kloroform Kekurangan : tidak selektif, dapat diuraikan oleh alkaloida basa kuat menghasikan asam klorid. Eter : lebih selektif Kekurangan eter : mdh teroksidasi membtk peroksida, mdh terbakar, derajat pencampuran dgn air relatif tinggi

Alkaloid netral/ Basa lemah ISOLASI Bahan material + PE 1). MeOH / EtOH 95% Sari PE 2). dipekatkan Sisa 3). EtOAc-as.tartrat 2% Sari EtOAc Alkaloid netral/ Basa lemah lart.as tartrat 2% Basakan dgn NH3 , Na2CO3 EtOAc Sari EtOAc Alk. Basa Fase air Alk. Am.kuarterner

PE : mengawalemakan As.tartrat : as.organic (asam lemah) shg yang tergaramkan adalah alkaloida basa kuat dan alkaloida kuarterner. Sedangkan alkaloida bas lemah dan netral tidak akan tergaramkan. Penambahan amoniak hrs hati-hati, why?

PEMURNIAN ALKALOID Kristalisasi Langsung Destilasi Uap Gradient pH Technique

Kristalisasi langsung Mrpk metode paling sederhana Jarang memberi alkaloid murni krn tdk selektif Bermanfaat bila didahului dgn pemisahan lain, mis : TLC preparative, kromatografi kolom.

Destilasi uap Metode ini tdk berlaku untuk alkaloida dgn BM besar. Alkaloid dgn BM kecil dapat dipisahkan dgn metode ini.

Destilasi

Gradient pH technique Metode didasarkan atas perbedaan pH / kebasaan alkaloid yang terdapat dalam campuran. Dgn mengubah pH larutan alkaloida yang diikuti dgn ekstraksi dgn pelarut organic, mk alkaloida pd pH tertentu dapat dipisahkan. Metode ini pernah dilakukan dan berhasil baik pada pemurnian alkaloid antikanker dari Catharanthus roseus (bunga warna putih). Larutan NH4OH NH4OH NH4OH NH4OH garam alk. PH 6.0 6,5 7,0 7,5 ….. 14 EtOAc EtOAc EtOAc EtOAc

IDENTIFIKASI ALKALOID Reaksi Pengendapan Reaksi Warna Reaksi pembentukan kristal KLT Spektrum UV Spektrum IR

Deteksi alkaloid: Peraksi pengendap: Larutan Alkaloid netral atau asam dpt diendapkan dg pereaksi yg berisi logam berat spt Hg, Bi. 1ml lart alkaloid dlm tb reaksi + 1ml HCl + REAGENT PPT. Mayer’s Reagent end krem Wagner’s Reagent end coklat Dargendorff (Kraut’s) end orange merah coklat Phosphomolybdic acid end putih Tannic acid end putih 62

Reaksi pengendapan Pereaksi Dragendorff : lart. K tetraiodobismutat. Pereaksi Mayer : Lart. K2HgI4 Pereaksi Marme : lart. Kadmium kalium iodida. Pereaksi wagner : Lart. Iodium kalium iodid Pereaksi Sonneschein : lart. Asam fosfomolibdat Pereaksi Schelber : lart. Asam fosfowalframat.

Reaksi warna Alkaloid dg pereaksi H2SO4 and HNO3 akan memberikan warna spesifik 1ml larutan alkaloid dlm cawan porselen + pereaksi waran. Pereaksi Marquis : camp. 2 tetes lart formaldehid & 1 ml H2SO4 Pereaksi Frohde : camp. Lart 1% ammonium molibdat & H2SO4 Pereaksi Mandelin: camp 0,5% ammonium vanadat dlm H2SO4 Pereaksi Vitali : 1 tetes larutan uji dibiarkan menguap residu + HNO3 pekat panaskan di ta, amati warna dibasahi dgn uap NH3 warna tertentu.

Tabel. Reaksi warna alkaloid Alkaloida Warna yang terbentuk dgn pereaksi Frohde Mandelin Marquis Morfin Violet-biru Biru-coklat Violet Kodein Biru hijau-coklat biru violet hidromorfin - Kuning-violet Tebain Hijau-kuning atropin merah Skopolamin Kuning-biru kinin Kuning-kehitaman Hijau kuning kuning papaverin Biru hijau Merah anggur

Reaksi Kristal Alkaloida + lart garam logam berat (emas klorida, platina klorida, merkuri klorida), asam pikrat atau asam pikrolonat end.kristal

kromatografi lapis tipis penggunaan KLT untuk identifikasi alkaloida dan senyawa lain telah berkembang dan mrpk alat analisis yang cukup peka, cepat dan terpercaya. Fase diam : silica gel G atau silica gel GF 254 Fase gerak: senyawa yang bersifat basa. Campuran methanol & ammonia ( 100 :1,5) Campuran benzen, aseton, eter & amoniak 25% (40:60:10:3) Campuran methanol, aseton, trietanolamin (30:30:1) Campuran kloroform, aseton & dietilamin (50:40:10)

Deteksi Bercak Alkaloid (KLT) Wagner, 1996 Sinar UV254 : Pemadaman kuat pd alkaloid indol, quinolin, isoquinolin, purin. Pemadaman lemah : alkaloid tropan Sinar UV 365 Berfluoresensi biru, biru-hijau, violet: akar rauvolfia, kulit kina, akar ipekak. Fluoresensi kuning: colchicine, sanguinarin, berberine Pereaksi Semprot: Dragendorff, iodoplatinat dll

Identifying the Spots Commercial TLC plate after development in normal lighting Same TLC plate held under a UV lamp - Note the appearance of additional spots

Interpreting the Data The Rf value for each spot should be calculated. Rf stands for "ratio of fronts" and is characteristic for any given compound on the same stationary phase using the same mobile phase for development of the plates. Hence, known Rf values can be compared to those of unknown substances to aid in their identifications.

Spektrum UV DAN IR Spektrum UV : Memberi petunjuk jenis gugus atau ikatan kimia yang ada dalam molekul. Spektrum IR: jenis gugus dan ikatan kimia

PENETAPAN KADAR ALKALOIDA Gravimetri Volumetri Kolorimetri Spektrofotometri

Metode gravimetric umumnya untuk alkaloida basa lemah yang tdk mungkin dilakukan titrasi. Alkaloid yang dianalisis ditimbang sbg alkaloida langsung atau diendapkan dulu dgn pereaksi tertentu. Keuntungan : tidak memerlukan pereaksi lain dan factor gravimetric dalam perhitungan kadar. Tdk terpengaruh oleh basa menguap krn hilang pada pengeringan Tdk tgt pada rumus atau BM alkaloida yang diuji. Kerugian: tidak dapat diterapkan untuk alkaloida yang menguap atau terurai padaa proses pengeringan (nikotin, efedrin). Alkaloida harus bebas dari pengotor yang larut organic yang digunakan pd penyarian. Jumlah cuplikan harus besar

Volumetric Metode yang digunakan adalah asidi-alkalimetri. Titrasi dapat dilakukan dalam lingkungan air atau bebas air. Prinsip : (lingkungan air) Penyarian dgn pelarut organic Alkaloida basa diuapkan sampai kering Dilarutkan dalam EtOH netral + indicator (umumnya MM pKa = 5,2) Titrasi dengan baku asam (HCl atau H2SO4) Prinsip : (lingkungan bebas air) Penyarian dengan pelarut organic Dilarutkan dalam asam asetat glacial + indicator kristal violet (violet-tak berwarna) Titrasi dengan baku asam perklorat

Kolorimetri Pereaksi warna yang digunakan asam pikrat, garam Reineckate (NH4(Cr (NH3)2(SCN)4), zat warna asam (biru brom timol, jingga metil, merah klorfenol), asam siliko wolframat dan aldehid. Asam pikrat : efedrin λ 445 nm Garam Reineckate : PK atropin Alkaloid + garam Reineckate end berwarna. End larut dlm aseton atau methanol λ 520 - 526 nm

Spektrofotometri uv keuntungannya : kepekaannya tinggi, dimungkinkan menetapkan beberapa komponen secara simultan.

Fluorometri Prinsip : Eksitasi dengan radiasi larutan pd λ tertentu Pengukuran intensitas fluoresensi pd λ tertentu Menentukan hubungan intensitas fluoresensi dengan konsentrasi menggunakan zat baku. Fuoresensi bbrp alk dipengaruhi pH : kinin & kinidin

Bagaimana memisahkan campuran senyawa alkaloida berikut ini