Kuliah VI. PENYIAPAN INOKULUM & METODE KULTIVASI m.K. Dasar Teknologi Mikrobial TIN 232 2(2-0) Kuliah VI. PENYIAPAN INOKULUM & METODE KULTIVASI Departemen Teknologi Industri Pertanian – FATETA IPB 2012

KULTIVASI DALAM BIOPROSES Penyiapan Inukulum Mikroba Penyiapan/ formulasi media Inokulasi secara aseptik Sterilisasi Perakitan bioreaktor dan strerilisasi Kultivasi: Pengontrolan suhu Pengontrolan pH Pengontrolan aerasi Pengontrolan agitasi Pengontrolan busa Sampling dan Pemanenan Analisis hasil kultivasi

Kurva Pertumbuhan (pada Kultivasi Curah) PENYIAPAN INOKULUM Inokulum : kultur mikroba yang diinokulasikan ke dalam media kultivasi  kultur mikroba aktif yang dipanen pada fase pertumbuhan eksponensial Kurva Pertumbuhan (pada Kultivasi Curah) http://www.google.co.id/imglanding?q=batch+culture

Kriteria Inokulum : Sehat & berada dalam keadaan aktif Tersedia dalam jumlah cukup, sehingga memenuhi ukuran optimum inokulum (3-10 % v/v) Berada dalam morfologi yang sesuai (A. niger  pelet) Bebas kontaminasi oleh mikroba lain yg tdk dikehendaki Dapat mempertahankan kemampuannya untuk membentuk produk yang diinginkan (secara genetik stabil) Dipengaruhi oleh media kultur yang digunakan

Penyiapan inokulum :  ditujukan untuk memperbanyak sel, bukan pembentukan produk  komposisi media untuk inokulum mungkin berbeda dengan media kultivasi (N tinggi  C/N lebih kecil)  untuk mempersingkat fase adaptasi, sebaiknya media kultur untuk inokulum mirip dengan media kultivasi Jumlah inokulum 3 – 10 % (v/v), sehingga kultur induk (kultur stok) yang dorman (tidak aktif) harus dikembangkan beberapa tahap, tergantung ukuran bioreaktor yang akan digunakan Pengembangan inokulum bertahap (multistaging) Kultur stok Penyegaran Labu Labu Tangki Teraduk Tangki Teraduk Kultur Thp I Thp II Thp I Thp II

Media cair Agar miring Inokulum Bioreaktor Propagasi Penyegaran Kultur Stok (dorman) Penyegaran (reaktivasi) Kultivasi Pada Bioreaktor

Tahap Kondisi Kultur Media Penting diperhatikan pada Pengembangan Inokulum : Resiko kontaminasi cukup besar  harus dilakukan secara aseptis & dilakukan pengujian kemurnian kultur (a.l cek dg mikroskop) Contoh Penyiapan Inokulum Bakteri Clostridium sp (produksi aseton-butanol) Tahap Kondisi Kultur Media I II III IV V Rekonstitusi isolat ampul Inokulasi ke media 600 ml Inokulasikan 90 ml ke dlm 3 L (labu erlenmeyer 4 L) Inokulasi ke dalam bioreaktor 25.000 L Inokulasi ke dalam bioreaktor 300.000 – 2.500.000 L (0,5 – 3 %) Potato Glucose Broth (pepton) Gula 4 % (Molase) (NH4)2SO4 5 %, CaCO3 6 %, fosfat 0,2 % Idem Thp II Idem Thp II (6 % gula) Idem Thp IV ditambah amonia

Penyiapan Inokulum Kapang Sebagian besar kapang membentuk spora aseksual  untuk pembuatan inokulum biasanya digunakan suspensi spora sebagai inokulum  Contoh : Penicillium chrysogenum (penisilin), Aspergillus niger (asam organik : contoh asam sitrat), Actynomicetes (antibiotika) Inokulasi spora langsung dapat mengurangi biaya produksi,  inokulasi setelah spora bergerminasi dapat mempersingkat waktu kultivasi Produksi spora dapat dilakukan dengan menggunakan media padat (agar, biji-bijian : kedelai, bekatul, beras, jagung giling, barley, malt dll) atau media cair Pada kultivasi cair (kultur terendam)  komposisi media & konsentrasi spora akan mempengaruhi bentuk kapang (filamen atau pelet) konsentrasi spora : bentuk filamen  viskositas : bentuk pelet (gumpalan)  viskositas

- sinambung (continuous) - semi sinambung (fed batch) METODE KULTIVASI Terdapat tiga metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor : - curah (batch) - sinambung (continuous) - semi sinambung (fed batch)   (Curah) (Semi sinambung) (Sinambung)

Pelaksanaan kultivasi : KULTUR CURAH Pelaksanaan kultivasi : Bioreaktor diisi dengan media segar steril lalu diinokulasi kultur mikroba (inokulum)  merupakan sistem tertutup Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk dilakukan pemanenan (proses hilir) Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk digunakan pada kultivasi berikutnya Penyiapan/pembersihan bioreaktor repot Selama kultivasi kondisi “unsteady-state” (S,P dan X berubah selama kultivasi)

KURVA PERTUMBUHAN KULTIVASI CURAH http://www.omicsonline.org/ArchiveJMBT/2010/May/03/JMBT-02-064.php (■) reducing sugar; (Δ)-lactic acid, (●) cell growth - with pH control and (□) reducing sugar; (Δ)-lactic acid, (O) cell growth - without pH control. (de Lima et al., 2010)

Kultur Curah (Batch) Neraca Biomassa rX = dX/dt  rx = X  Plot ln X vs t akan memperoleh nilai  Ln X Keterangan :  : laju pertumbuhan spesifik (waktu-1) F : laju alir (vol/waktu) X : konsentrasi biomassa (g/l)  t

Karakteristik Kultur Curah : Resiko kontaminasi rendah Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika   Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi 4. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor yang sama (Contoh : produksi metabolit sekunder e.g antibiotik pertumbuhan sel pada fase eksponensial & pembentukan produk pada fase stasioner) 5. Dari aspek rekayasa proses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil 6. Kelemahan : produk yang menghambat pertumbuhan terakumulasi, sehingga metabolisme sel terganggu

Aplikasi Kultur Curah : Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder Untuk produksi biomassa  digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa (nutrisi/O2 unt m.o aerob mencukupi), sehingga mencapai maksimal Untuk prodiksi metabolit primer  kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan sintesis produk (pengaturan konsentrasi substrat) Untuk produksi metabolit sekunder  kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasioner  pengaturan nutrisi media

KULTUR SINAMBUNG Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan dg laju alir yanga sama (Sistem Terbuka) Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah. Dapat mengatur konsentrasi sel mikroba untuk mengoptimalkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya.  Imobilisasi sel , contoh : melekatkan mikroba pada carrier atau menempatkan sel dalam matriks alginat

Kultivasi sinambung (Kemostat) : laju pertumb. dikendalikan Ciri khas : kondisi lingkungan (suhu, pH, O2 dan konsentrasi nutrien) dapat dipertahankan tetap (steady-state)  kons. biomassa atau µ (laju pertumbuhan spesifik) dapat diatur & konstan dipertahankan selama kultivasi (dg mengatur kons. substrat umpan) Source : Microbial G rowth Kultivasi sinambung (Kemostat) : laju pertumb. dikendalikan oleh komp. tunggal pd medium (substrat pembatas)  X = yx/s (S0 – S)

Kultur Sinambung Kultur Sinambung Neraca Biomassa : X S F0 (l/jam) S0 (g/l) X0 (g/l) = 0 (umpan steril m.o) F (l/jam) S (g/l) X (g/l) F (laju alir) F0 = F Kultur sinambung dijalankan setelah tercapai Xmaks Neraca Biomassa : V (jam-1)  S, P dan X tetap Keterangan : D = laju dilusi = F/V (jml vol kultur yang melalui bioreaktor)

http://sbli. ls. manchester. ac http://sbli.ls.manchester.ac.uk/fungi/21st_Century_Guidebook_to_Fungi/Ch17_11.htm

Kurva Pengaruh D ( laju dilusi = F/V) pada Kultur Sinambung X,S,P P X S D Kurva Pengaruh D ( laju dilusi = F/V) pada Kultur Sinambung (D menggambarkan lamanya umpan berada di dlm bioreaktor )

Kultur Sinambung : Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi (mikroba rekombinan kadang tidak stabil sifat genetiknya) Produktivitas lebih tinggi Dapat dijalankan pada waktu yang lama Harus ada pasar/konsumen ang tetap terhadap produk Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah (contohnya penanganan limbah cair) & produk yang berasosiasi dengan pertumbuhan Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana Tidak ada akumulasi produk yang menghambat

4-EG : ethyl guaicol Immobilized glutaminase and immobilized cells of P. halophilus, Z. rouxii, and C. versatilis http://www.nzdl.org/gsdlmod?e=d-00000-00---off-0hdl--00-0----0-10-0---0---0direct-10---4-------0-1l--11-en-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0utfZz-8-00&a=d&c=hdl&cl=CL1.1&d=HASH8403ef70002be1ecf3acbb.6.5

Untuk produksi PST (protein sel tunggal) Aplikasi Kultur Sinambung : Merupakan ‘alat’ untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba, dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir umpan (laju pertumbuhan dikendalikan oleh konsentrasi substrat pembatas)  dapat digunakan untuk penelitian, contohnya pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambung Untuk produksi PST (protein sel tunggal) contoh ICI (Imperial Chemical Industries), menggunakan substrat metanol  bioreaktor kombinasi “air-lift” dan “loop reactor”

http://www. nzdl. org/gsdlmod http://www.nzdl.org/gsdlmod?e=d-00000-00---off-0hdl--00-0----0-10-0---0---0direct-10---4-------0-1l--11-en-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0utfZz-8-00&a=d&c=hdl&cl=CL1.1&d=HASH8403ef70002be1ecf3acbb.6.5

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022998000982

Produki Etanol secara Sinambung dengan Daur-ulang Sel Khamir http://collections.infocollections.org/ukedu/en/d/Jb23ale/6.html#Jb23ale.6

KULTUR Semi Sinambung (FED BATCH) Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor secara kontinyu/sekuensial tanpa pengeluaran isi bioreaktor Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali. Harus disediakan ruang dalam bioreaktor (head space) untuk penambahan media http://www.thefullwiki.org/Fed-batch Meskipun total biomassa meningkat terhadap waktu, namun konsentrasi sel tetap mengingat volume juga meningkat, akibat ada penambahan media/umpan dX/dt = 0  μ ~ D (quasy-steady state)

http://sbli. ls. manchester. ac http://sbli.ls.manchester.ac.uk/fungi/21st_Century_Guidebook_to_Fungi/Ch17_10.htm

Kelebihan Kultur Semi Sinambung : Karena dapat mempertahankan konsentrasi substrat pada level rendah, sehingga : - mencegah efek represi katabolit akibat konsentrasi substrat yang tinggi (contoh glukosa) - dapat dilakukan pengontrolan laju pertumbuhan mikroba dan mengatur kebutuhan oksigen bagi mikroba Contoh : Produksi Saccharomyces cerevisiae (ragi roti) : secara industri diproduksi dengan cara semi sinambung dengan mempertahankan konsentrasi glukosa tetap rendah, sehingga rendemen biomassa maksimum dan meminimumkan produksi hasil samping etanol Produksi Penisilin (metabolit sekunder) : dengan kultivasi 2 tahap (thp I : glukosa unt. Prod. biomassa dan thp II : glukosa untuk prod.penisilin)

Silva et al. 1998 Braz. J. Chem. Eng. vol. 15 n. 4 São Paulo Dec. 1998 Concentration profiles of glucose, biomass and cephalosporin C (CPC) during fed-batch fermentation

KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBA Kurva Pertumbuhan Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian http://www.google.co.id/imglanding?q=batch+culture

X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering) Fase Eksponensial : Keterangan : X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering) µ = laju pertumbuhan spesifik (1/jam) t = waktu (jam) Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai Model Pertumbuhan Eksponensial (diturunkan dari neraca massa)

Plot antara ln[Sel] terhadap waktu akan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase eksponensial

Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel  2  4  8 …. dst Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ? Perhatikan sel tunggal (contoh bakteri) di dalam bioreaktor. Sel ini membelah diri tiap satuan waktu. Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan sbb. Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel  2  4  8 …. dst 1  21  22  23  24 …………..  2n = N (jumlah sel) Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi

Growth of Microbial Populations

Laju spesifik pertumbuhan (µ) : - Menggambarkan kecepatan reproduksi sel. - Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. Model Pertumb Eksponensial Pada saat fase eksponensial, laju spesifik pertumbuhan relatif tetap

Hasil integrasi : Terakhir: Finally: Terakhir: Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial antara konsentrasi biomassa dengan waktu

Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik : Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus.

tD menggambarkan waktu yang diperlukan untuk Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = tD) dengan laju spesifik pertumbuhan tD menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan populasi sel menjadi 2X jumlah(kons) semula  menggambarkan laju pertumbuhan sel Selama fase eksponensial tD relatif konstan Hubungan antara tD dengan laju pertumbuhan spesifik  bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X0 menjadi X1 selama waktu penggandaan tD (= t 1- t0) : tD = = 0.692/µ

During the exponential phase, each microorganism is dividing at constant intervals. Thus the population doubles in number during a specific length of time called the generation (doubling) time . For a given species of a bacterium, the doubling time, td, is a kind of species-specific, unchangeable characteristic: every bacterial species has a particular, genetically fixed doubling time under optimal growth conditions. The doubling time of a given bacterial species growing optimally can thus be regarded as a fixed value. For many common bacteria, the generation time is quite short, 20-60 minutes under optimum conditions. For most common pathogens in the body, the generation time is probably closer to 5-10 hours.

The relationship between the number of bacteria in a population at a given time (Nt), the original number of bacterial cells in the population (No), and the number of divisions those bacteria have undergone during that time (n) : Nt = No X 2n For example, Escheichia coli, under optimum conditions, has a generation time of 20 minutes. If one started with only 10 E. coli (No = 10) and allowed them to grow for 12 hours (n = 36; with a generation time of 20 minutes they would divide 3 times in one hour and 36 times in 12 hours), the number of bacteria after 12 hours (Nt ) Nt = 10 X 236 = 687,194,767,360 E. coli