Mutasi Gen embB Isolat Klinis L16 dan L21 Multidrug Resistant Mycobacterium tuberculosis Icha Isana Febriana / 10506067 Pembimbing : Achmad Saifuddin Noer, Ph.D Seminar Tugas Akhir 9 April 2017 of 21

AGENDA PRESENTASI 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir PENDAHULUAN METODE PENELITIAN HASIL PEMBAHASAN KESIMPULAN 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

PENDAHULUAN Mycobacterium tuberculosis (M. tb) adalah bakteri penyebab tuberkulosis (TB) pada manusia Setiap tahun, TB menginfeksi 9 juta jiwa dan membunuh 1,5 juta jiwa di dunia (WHO, 2008) Salah satu faktor meningkatnya infeksi TB di dunia disebabkan oleh mutasi M. tb di tingkat genotipe 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Mycobacterium tuberculosis M. tb adalah bakteri patogen utama yang menyerang sistem pernafasan mamalia Bakteri M. tb berbentuk basil (batang) dan bersifat tahan asam Bakteri ini mampu bertahan beberapa jam di tempat gelap, lembab, dan dapat bersifat dormant (tidur) di dalam tubuh manusia. 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Peta Genom M. tb [http://wishart.biology.ualberta.ca/BacMap/graphs_cgview.html] Genom M.tb berukuran 4,4 x 106 pb dan memiliki >> 4000 gen Operon embCAB 10 kb Tipe mutasi pada gen biasanya bervariasi di daerah geografis yang berbeda (Ramaswamy and Musser, 1998) 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Tuberkulosis Tuberkulosis adalah salah satu penyakit mematikan (www.TBCindonesia.or.id) EMB bekerja sebagai analog arabinosa yang akan menghambat kerja enzim arabinosiltransferase, sehingga sintesis arabinan untuk pembentukan dinding sel akan terganggu dan mengakibatkan akumulasi asam mikolat, sehingga bakteri mati. 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Obat Anti Tuberkulosis OAT yang tersedia untuk menangani TB terdiri dari 2 jenis : a. lini pertama : isoniazid, rifampisin, pirazinamid, etambutol dan streptomisin b. lini kedua : etionamid, kanamisin, quinolones, dll. Etambutol bekerja dengan cara menghalangi pembentukan dinding sel bakteri Struktur Etambutol 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Etambutol Sasaran etambutol adalah protein arabinosiltransferase yang dikode oleh gen embB pada operon embCAB gen embB memiliki ukuran 3297 pb Diketahui bahwa sebagian besar mutasi yang mengakibatkan resistensi terhadap etambutol terjadi pada kodon 306 dari gen embB (Sreevatsan dkk., 1997) 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Diagram Alir Penelitian Isolat L16 dan L21 Koleksi Isolat MDR-M. tb Pemilihan Sampel Kode L : BPLK ; Kode R : RS. Rotinsulu, Bandung Sampel L16 : Mutasi C1594T pada gen rpoB (Ser  Leu) (Noviana, 2007) Sampel L21 : Mutasi pada gen katG294T884C (mutasi bisu) (Noviana, 2007) Mutasi C1594T pada gen rpoB (Ser  Leu) (Noviana, 2007) Isolat M. tb Koleksi Laboratorium Biokimia, ITB Amplifikasi Berhasil Amplifikasi fragmen gen embB dengan PCR Elektroforesis Gel Agarosa Urutan Nukleotida Fragmen Gen embB Sequencing Analisis In Silico Data 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA Metode Penelitian PCR Pembuatan master mix PCR Amplifikasi fragmen gen embB dengan kondisi PCR yang telah ditentukan ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA Pembuatan gel agarosa (agarosa, TAE 1x, EtBr) λ = 312 nm, dengan marker pUC19/HinfI SEQUENCING Metode dideoksi Sanger dan mengikuti prosedur BigDye Terminator oleh Macrogen Inc., Korea ANALISIS IN SILICO Analisis in silico menggunakan program EditSeq dan SeqMan dari DNASTAR versi 4.0.0 Buffer PCR dan MgCl2, primer, Taq Polimerase, dNTP, dan templat DNA 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Polymerase Chain Reaction 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Kondisi PCR 95,0 ˚ 5,00 1,00 72,0 ˚ 4,00 4,0 ˚  9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Posisi Penempelan Primer Urutan primer yang digunakan (Clemente dkk., 2008): embF : 5’ – GGTGCGCGCCATGCCACC – 3’ (261-278) embR : 5’ – GGTCTGGCAGGCGCATCC – 3’ (1046-1063) Posisi Penempean Primer 5’ 3’ 261 1063 embR embF 0,8 kb 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

HASIL : Pita Elektroforesis Isolat L16 Isolat L21 pUC19/HinfI L21 H37Rv (+) (-) pUC19/HinfI (-) H37Rv (+) L16 1419 1419 0,8 kb 519 519 0,8 kb 397 397 214 214 75 75 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Elektroforegram Isolat L16 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Analisis Hasil Sequencing Isolat L16 9 April 2017 of 20 Seminar Tugas Akhir

Analisis Hasil Sequencing Isolat L21 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

Terjemahan Ke “Bahasa” Protein 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

PEMBAHASAN Pada isolat L16, tidak terdapat mutasi di kodon 306 dari gen embB. Sifat resistensi etambutol dapat melibatkan beberapa gen lain, selain embB (Telenti dkk., 1997). Clemente (2008) : hanya 70% dari keseluruhan EMB resisten menunjukkan mutasi embB Sebanyak 35% dari isolat yang tidak ada mutasi di gen embB menunjukkan penurunan tingkat resistensi terhadap EMB (Sekiguci, dkk., 2006) 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

PEMBAHASAN Pada isolat L21, perubahan urutan nukleotida pada kodon 306 : ATG  GTG Kodon 306 dan sekitarnya menjadi lebih hidrofob. Hal inilah yang diduga menjadi penyebab EMB sulit terikat dan tidak mampu menginhibisi pembentukan dinding sel bakteri. 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir

KESIMPULAN Sifat resistensi M. tb terhadap etambutol tidak selalu akibat adanya mutasi pada kodon 306. Kodon 306 merupakan hot spot penyebab resistensi etambutol. Daerah kodon 306 dapat digunakan untuk pengembangan diagnostik kit untuk deteksi M. tb yang resisten etambutol 9 April 2017 of 21 Seminar Tugas Akhir