Teknologi DNA Rekombinan

Enzim Restriksi Fungsi: melindungi bakteri dari DNA asing (seperti virus). DNA organisme penghasil enzim mengalami metilasi sehingga tidak dapat dipotong Enzim restriksi tipe I: memotong DNA pada jarak 1000 bp atau lebih dari sisi pengenalan Enzim restriksi tipe II: memotong pada bagian tengah sisi pengenalan. Memotong DNA untai ganda pada titik yang sama menghasilkan ujung tumpul (blunt end) Memotong DNA pada titik yang berbeda menghasilkan ujung lancip (sticky end)

Jumlah bp menentukan kemungkinan untuk menemukan sisi pemotongan. Untuk menghasilkan fragmen DNA yang lebih panjang digunakan enzim restriksi dengan sisi pengenalan enam atau lebih bp

DNA Ligase DNA ligase dari T4 bacteriophage. Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3’- OH dari satu untai dan 5’-PO4 dari untai DNA lain Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip dibanding dengan ujung tumpul.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Deteksi Asam Nukleat Ultraviolet DNA menyerap sinar UV karena struktur cincin pada basa RNA dan juga nukleotida menyerap sinar UV Konsentrasi DNA ditentukan pada panjang gelombang 260 nm

Penandaan DNA dengan Radioaktif Sinar UV dapat mendeteksi DNA, tetapi tidak dapat membedakan molekul DNA yang berbeda. Prekursor nukleotida radioaktif 32P atau 35S ditambahkan dalam medium pertumbuhan. Autoradiografi digunakan untuk mendeteksi DNA bertanda. Peluruhan radioaktif menghasilkan radiasi yang dapat menyebabkan film fotografi menjadi hitam

DNA radioaktif dapat dideteksi dengan scintillation counting. Peluruhan isotop radioaktif menghasilkan partikel beta. Cairan scintillation akan mengalami eksitasi dan kemudian mengemisikan sinar Scintilation counter akan mendeteksi sinar yang diemisikan .

Deteksi DNA dengan Fluoresens Fluoresecence tags menyerap cahaya pada satu panjang gelombang . Atom mengalami eksitasi yang selanjutnya akan memancarkan cahaya dengan panjang gelombang berbeda ketika kembali ke keadaan dasar. Foton yang diemisikan akan dideteksi oleh detektor

Biotin dan Digoxigenin Biotin adalah vitamin Digoxigenin adalah hormon steroid dari tumbuhan foxglove. Biotin atau digoxigenin berikatan dengan urasil DNA hasil sintesis mengandung dUTP- biotin/digoxigenin, menggantikan dTTP

DNA bertanda dengan senyawa yang dapat berfluoresens

Visualisasi DNA bertanda:

DNA: Melting dan Reannealing DNA dapat mengalami ‘melting’ dan bergabung kembali ‘reanneal’ Pemanasan dapat merusak ikatan hidrogen. Pada pendinginan perlahan dapat terbentuk ikatan hidrogen antar kedua untai DNA yang saling komplemen.

Southern Blot (Ed Southern)

SB digunakan untuk menentuk kedekatan DNA dari satu sumber dengan DNA dari sumber lain. Isolasi DNA target Pemotongan dengan enzim restriksi Pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis Pemisahan DNA untai ganda dengan cara menginkubasi gel dengan asam kuat. Transfer DNA untai tunggal ke membran Pembuatan probe/pelacak Denaturasi DNA pelacak. Hibridisasi DNA target dengan DNA pelacak

High stringency: Temperatur tinggi dan konsentrasi garam rendah High stringency: Temperatur tinggi dan konsentrasi garam rendah. DNA templat dan pelacak berhibridisasi sempurna Low stringency: temperatur rendah dan kadar garam tinggi. DNA templat dan pelacak mempunyai mismatches.

Nothern Blot Target molekul: RNA Variasi teknik hibridisasi: dot blot

Zoo Blot: Kemiripan urutan nukleotida antara beberapa spesies yang berbeda

Fluorescene In Situ Hybridization Hibridisasi pelacak dengan DNA/RNA di dalam sel. Sumber DNA: sayatan jaringan, kultur mamalia, kultur serangga, darah (sel darah putih). Pemanasan sampel DNA Hibridisasi dengan pelacak bertanda (fluoresens)

Analisis FISH gen RUNX1 yang mengalami peningkatan jumlah kopi pada penderita leukemia akut karena polisomi pada kromosom 21. RUNX1: Merah; TEL: Hijau

Vektor Kloning Herbert W Boyer: enzim restriksi dan pemodifikasi Stanley N. Cohen: Plasmid resistan antibiotik dan teknik transformasi dengan CaCl2.

Vektor Kloning Ukuran kecil, mudah dimanipulasi Dapat ditransfer dari sel ke sel Mudah diisolasi Mudah dideteksi dan diseleks Plasmi multi kopi (membantu utk mendapatkan DNA dalam jumlah besar) Mempunyai beberapa sisi pengenalan enzim restriksi Ada metode untuk mendeteksi keberadaan DNA insert

Vektor Kloning Umum