XV. TEKNOLOGI FERMENTASI II Proses Konversi Yang Memanfaatkan TIN 321 / 2 (2-0) m.k. SATUAN PROSES XV. TEKNOLOGI FERMENTASI II Proses Konversi Yang Memanfaatkan Teknologi Fermentasi DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Kelebihan Pemanfaatan Mikroba pada Industri : a. Ukuran sangat kecil, nisbah permukaan thd volume tinggi, sehingga difusi nutrien lbh cepat  reaksi metabolisme lebih cepat b. Keragaman kemampuan konsumsi substrat tinggi  industri fermentasi tidak tergantung pada suatu jenis substrat c. Pada kondisi proses fermentasi optimal, mikroba mampu mempertahankan sifat fisiologisnya dan memproduksi enzim dgn segera

JENIS PRODUK FERMENTASI 1. Biomassa sel mikroba sbg produk (ragi roti, PST, Lactobacillus ) 2. Enzim mikrobial (katalase, amilase, protease, pektinase, glukosa isomerase, sellulase, hemisellulase, lipase, laktase, ) 3. Metabolit (primer & sekunder) 4. Senyawa kimia hasil biotransformasi (asam asetat, sorbosa, antibiotika, steroid dll) 5. Recombinant products: insulin, HBV, interferon, GCSF, streptokinase

Metabolit Primer Merupakan senyawa yang diproduksi pada fase logaritmik (tropophase)  penting untuk hidup & reproduksi sel Senyawa antara pada jalur biosintesis produk akhir, yaitu asam amino (asam glutamat, lisin dll), nukleotida (I+G = Ribotide), vitamin, polisakarida, etanol Senyawa antara pada jalur Embden-Meyerhof, Pentosa-Fosfat dan Siklus Krebs, contoh asam-asam organik (asam sitrat, asam fumarat dll).

Metabolit Sekunder Molekul yang disintesis oleh mikroba pada saat akhir hidupnya (pada fase stasioner/idiophase) Tidak diperlukan untuk pertumbuhannya dapat sebagai nutrient darurat untuk bertahan hidup atau sbg pertahanan diri thd lingkungan yang buruk Ciri-ciri : Spesifik untuk satu/beberapa spesies m.o Produksinya dipengaruhi faktor lingkungan Beberapa diiproduksi sebagai kelompok produk dengan struktur mirip, contoh : 3 neomisin 10 polimisin 10 basitrasin 20 penisilin 6 tirosidin 20 aktinomisin 8 aflatoksin 5 mitomisin Metabolit sekunder penting : antibiotika, mikotoksin, pigmen

Komponen Proses Fermentasi Formulasi media untuk penyiapan inokulum dan medium produksi 2. Sterilisasi media & fermentor/bioreaktor + perlengkapannya 3. Produksi inokulum yang aktif, murni dengan jumlah yang mencukupi 4. Pertumbuhan mikroba dalam fermentor pada kondisi optimum untuk pembentukan produk 5. Ekstraksi produk dan pemurniannya (Proses Hilir) 6. Pembuangan buangan/limbah yang dihasilkan selama proses

SKEMA PROSES FERMENTASI Biomassa Pengembangan Inokulum Cairan Fermentasi Pemisahan Sel Kultur Stok Labu Kocok Fermentor Bibit Supernatan Bebas Sel Fermentor Produksi Ekstraksi Produk Sterilisasi Media Formulasi Media Bahan-bahan Media Penanganan Limbah Purifikasi Produk Pengemasan Produk

METODE FERMENTASI/KULTIVASI Metode fermentasi berdasarkan cara operasi bioreaktor : - curah (batch) - sinambung (continuous) - semi sinambung (fed- batch)   Continuous

* Kurva Pertumbuhan Bakteri Kultivasi Curah Log jumlah bakteri hidup A = fase lamban (lag phase) B = fase cepat (log phase/eksponensial) C = fase statis (stationary phase) D = fase kematian / penurunan (death phase, decline phase)  X, P & S berubah thd waktu C D B A Waktu Kultivasi (jam)

Karakteristik Kultur Curah : Selama kultivasi S,P dan X berubah selama kultivasi)  kondisi “unsteady-state” Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika   Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi (mikroba rekombinan kadang tidak stabil sifat genetiknya) 4. Dari aspek rekayasa proses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil 5. Kelemahan : produk yang menghambat pertumbuhan terakumulasi

Karakteristik Kultur Sinambung Media segar secara kontinyu ditumpankan ke dalam bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan (Sistem Terbuka) Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi & mensintesis produk menggunakan media segar yang diumpankan, dan pada saat yang bersamaan produk, dan sel dikeluarkan dari bioreaktor (laju alir sama, shg V sama)  X, P & S tetap thd waktu (steady-state) Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit pembersihan dibandingkan sistem curah. Sel mikroba/enzim diimobilisasi untuk meningkatkan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang

Fermentasi Semi Sinambung (Fed-Batch) Kultur ini merupakan kultur curah yang diberi umpan secara sinambung atau sekuensial, tanpa pengeluaran isi bioreaktor, sehingga volume bervariasi selama kultivasi  konsentrasi nutrien bervariasi Keuntungan : dapat menekan efek represif sumber karbon dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor Meskipun total biomassa meningkat terhadap waktu, namun konsentrasi sel tetap mengingat volume juga meningkat, akibat ada penambahan media/umpan dX/dt = 0  μ ~ D (quasy-steady state)

CONTOH FERMENTASI

FERMENTASI ASAM LAKTAT  Produksi secara Curah Asidulan yang paling efektif, rasanya enak dan pengawet kuat pangan Aplikasi : obat-obatan, minuman, makanan (acar, sauekraut, fermented cereals, yogurt, sour dough bread & susu fermentasi), bioplastik PLA dan penyamakan kulit Kelebihan sisi kesehatan : tidak menciptakan unsur asing di pangan, dapat digunakan pada produk berkalsium, mudah larut dan digunakan pada minuman olahraga/sport serta dapat untuk mengatur pH .

Bakteri Asam Laktat (BAL) ada 2 gol yaitu : Homofermentatif (memproduksi hanya asam laktat) Heterofermentatif (memproduksi asam laktat, asetat, etanol & CO2)  tidak cook untuk industri Perbedaan pola fermentasi: BAL Homofermentatif : hanya menggunakan lintasan EMP  genus beberapa Lactobacillus, Streptococcus , Pediococcus dan Lactococcus dll BAL Heterofermentif : melalui lintasan Fosfoketolase  genus Leuconostoc dan beberapa Lactobacillus dll Jenis Mikroba : - L delbrueckii : substrat glukosa - L. bulgaricus : whey - L. pentosus : sulfite waste liquor

BAL Homofermentatif Homolactic acid bacteria (Lactobacillus, Lactococcus and most streptococci)  used to ferment milk and milk products in the manufacture of yogurt, buttermilk, sour cream, cottage cheese, cheddar cheese, and most fermented dairy

BAL Heterofermentatif  Lintasan Pentosa Fosfat Glucose -------> Lactic acid + ethanol + CO2 + 1 ATP (net).

2 CH3CHOHCOOH Asam laktat Reaksi pada Fermentasi & Pemanenan Asam Laktat a) Fermentasi dan Netralisasi fermentasi C6H12O6  Karbohidrat  Ca (OH)2 Kalsium hidroksida      + (2CH3CHOHCOO- ) Ca2+ kalsium laktat + 2H2O (b) Hidrolisis oleh H2SO4 (2CH3CHOHCOO- ) Ca2+ Kalsium laktat + H2SO4 Asam sulfat  2 CH3CHOHCOOH Asam laktat + Ca SO4 Kalsium sulfat The broth containing calcium lactate is filtered to remove cells, carbon treated, evaporated and acidified with sulphuric acid to get lactic acid and calcium sulphate. The insoluble calcium sulphate is removed by filtration; lactic acid is obtained by hydrolysis, esterification, distillation and hydrolysis

2 CH3CHOHCOOH Asam laktat + CH3OH Metanol (c) Esterifikasi 2 CH3CHOHCOOH Asam laktat + CH3OH Metanol  CH3CHOHCOOCH3 Metil laktat + 2H2O  distilasi (d) Hidrolisis oleh H2O CH3CHOHCOOCH3 Metil laktat + 2H2O 2 CH3CHOHCOOH Asam laktat + CH3OH Metanol 

Penentuan kondisi terbaik Fermentasi Asam Laktat Menggunakan mikroba Lactobacillus casei FNCC 266 & Rhizopus oryzae Variasi konsentrasi total gula (hidrolisat pati) Variasi jenis sumber nitrogen : (NH4)2SO4 dan urea Waktu fermentasi s.d 72 jam (Lactobacillus casei FNCC 266 ) dan s.d 6 hari (Rhizopus oryzae)

Diagram Alir Fermentasi Asam Laktat Kultur Murni L. casei FNCC266 Propagasi dalam media hidrolisat pati 2% (20 – 24 jam, 37 0C, 150 rpm) Kultur inokulum Fermentasi dalam Waterbath Shaker (150 rpm, 370C, 72 jam) Asam Laktat Parameter : pH, Bobot Sel Kering, Total Asam/Asam Laktat, Gula Sisa

Komposisi Media Fermentasi L. casei FNCC266 No. Media Komposisi Sumber C Sumber N 1 C1N1 Hidrolisat pati sagu 1% Amonium sulfat 1,519% 2 C2N1 Hidrolisat pati sagu 2% 3 C3N1 Hidrolisat pati sagu 3% 4 C1N2 Urea 0,584 % 5 C2N2 6 C3N2

Fermentasi Asam Laktat Oleh B. casei FNCC266 a. pH cairan fermentasi b. Bobot Kering Biomassa c. Gula Sisa d. Total Asam

Yx/s (g biomassa/g substrat) 0,074 Yp/s (g produk substrat) 0,418 Bioreaktor 2 L Fermentasi Asam Laktat Oleh L. casei FNCC266 Parameter Kinetika Nilai maks (/jam) 0,284 Yx/s (g biomassa/g substrat) 0,074 Yp/s (g produk substrat) 0,418 Laju konsumsi substrat (g/l.jam) 0,191 Asam laktat tertinggi : 12,48 g/l

Poli (3-hidroksialkanoat) = PHA dengan Fermentasi Fed-Batch Contoh Produksi Fungsi PHA : sebagai cadangan karbon dan energi mikroba bila kondisi lingkungan buruk /tidak seimbang (nutrien menipis) Struktur kimia PHA Aplikasi : bioplatik yang biodegradabel

Ralstonia eutropha Bakteri Gram negatif, suhu pertumbuhan 20-37oC, digunakan dalam produksi PHA karena dapat mengakumulasi PHA hingga 90% dari bobot kering selnya. Akumulasi PHA dalam sel R. eutropha dipicu oleh kondisi pertumbuhan tidak seimbang (C berlebih, nutrisi lain terbatas) Nutrisi pembatas pemicu akumulasi PHA dalam R. eutropha : N (amonia/amonium), oksigen, P (fosfat), Mg atau sulfat (Klem 1999, Lefebvre et al. 1997)

Mengapa fed-batch ? PHA produk intraseluler  tergantung konsentrasi sel Akumulasi PHA oleh R. eutropha dipicu oleh kondisi tak seimbang, [C]>>, nutrisi lain terbatas : Tahap 1 (batch) : nutrisi seimbang ~ laju pertumbuhan spesifik tinggi => pembentukan biomassa Tahap 2 (fed-batch) : nutrisi tidak seimbang ~ induksi akumulasi PHA

Data Kinetika Kultivasi R eutropha secara Curah pada Bioreaktor 2 L (Konsentrasi Total Gula 30 g/l) Waktu (jam) X (g/l) (X-Xo) Ln X (g.l) µ (1/jam) S (So-S) 0,29 0,00 -1,228 24,34 12 1,09 0.79 0,083 0,109 21,86 2,48 24 2,19 1,89 0,782 0,058 19,18 5,16 36 3,54 3,24 1,263 0,040 9,17 15,17 48 4,32 4,03 1,462 0,017 1,41 22,93 60 4,21 3,92 1,437 -0,002 0,48 23,86 72 4,46 4,17 1,495 0,005 0,39 23,95 84 -0,005 0,31 24,03 96 4,41 4,12 1,484 0,004

Pertumbuhan sel R. eutropha vs konsumsi gula (curah, bioreaktor 2 liter) PARAMETER NILAI µmaks 0,109/jam Yx/s 0,15 g sel/g gula Yp/s 0,06 g PHA/g gula Yp/x 0,38 g PHA/ g sel ΔS/So 0,99 Fase stasioner ketika residu gula ~ 1 g/L : mulai jam ke-48 Pola pembentukan PHA : mixed growth associated

Konsentrasi dan rendemen PHA dalam sel pada kultivasi batch Vs fed-batch (dengan perlakuan jenis media pengumpan) F1 : Umpan media lengkap seperti media awal batch F2 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu  rendemen tertinggi F3 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu + MgSO4 F4 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu + (NH4)2HPO4 + MgSO4

Interpretasi Hasil Perolehan PHA F2 > F3 > F4 Terdapat indikasi bahwa N, P, MgSO4 merupakan nutrisi pembatas yang dapat meningkatkan akumulasi PHA. Pengumpanan hidrolisat pati sagu menyebabkan kultur kelebihan karbon, sedangkan N, P, MgSO4 menjadi terbatas sehingga rangkaian karbon mengalir ke jalur sintesis PHA, bukan ke siklus TCA (Babel et al 2001). Substrat pengumpan terpilih : Hidrolisat pati sagu (f2)

[sel] dalam media (g/L) [PHA] dalam media (g/L) Rekapitulasi konsentrasi sel dan PHA pada akhir kultivasi batch dan fed-batch PERLAKUAN [sel] dalam media (g/L) [PHA] dalam media (g/L) Kadar PHA dalam sel (%b/b) Batch (kontrol) 4,41 ± 0,32 1,44 ± 0,27 32,65 ± 6,56 Pengumpanan F1 F2 F3 F4 3,34 ± 0,11 4,86 ± 0,14 3,67 ± 0,28 4,58 ± 0,24 2,15 ± 0,03 3,72 ± 0,24 2,12 ± 0,05 1,85 ± 0,06 64,37 ± 2,30 76,54 ± 5,41 57,77 ± 4,61 40,39 ± 2,49 Pembatasan aerasi Ao F5 3,39 ± 0,21 4,13 ± 0,52 1,65 ± 0,14 2,68 ± 0,08 48,67 ± 5,11 64,89 ± 8,40 F1 : Umpan media lengkap seperti media awal batch F2 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu F3 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu + MgSO4 F4 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu + (NH4)2HPO4 + MgSO4 F5 : Media pengumpan hidrolisat pati sagu + aerasi dihentikan mulai jam ke-48 Ao: Tanpa pengumpanan, aerasi dihentikan mulai jam ke-48

Perbandingan Kultivasi batch Vs fed-batch F2 Konsentrasi dan rendemen PHA F2 cenderung meningkat setelah diumpan

FOTO PRODUK PHA Lembaran PHA Serbuk PHA

Produksi Vitamin C http://www.health32.com/n-ice-with-vitamin-c/

Methods of producing vitamin C Reichstein process (mixed fermentation & chemical synthesis method.) Glucose Sorbitol* *Sorbitol is made by hydrogenation glucose at high temperature. & pressure Sorbose + aceton  diaceton sorbose Diacetone sorbose, then oxidized using chlorine and sodium hydroxide to produce diacetoneketogulonic acid (DAKS). Purified by recrystallization Fermentation by Acetobacter Sorbose Diaceton L-sorbose DAKS Raw vitamin C Raw vitamin C

Two-step Fermentation Process Sorbitol fermentation Sorbose KGA Raw vitamin C Purified vitamin C KGA (keto gulonic acid) then undergo ring-closing lactonization via dehydration  Ascorbic acid (Vit C) The two-stage fermentation process makes less use of toxic solvents and reagents  reduction in the cost of processing waste products. This method is used predominantly in ascorbic acid industry in China, which supplies 80% of world's ascorbic acid

Thank You !