Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062 APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062 APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE."— Transcript presentasi:

1 SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS PADA KEPITING UNIVERSITAS PADJADJARAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN PROGRAM STUDI PERIKANAN JATINANGOR Dibawah bimbingan: Ir. Ibnu Dwi Buwono, Msi Ir. Evi Liviawaty, MP

2 LATAR BELAKANG... Produksi Udang Windu Serangan virus white spot Organisme Carrier PCR KonvensionalPCR Konvensional Real Time PCR Metoda Deteksi Virus

3 PCR Konvensional PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA target secara in vitro. Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis.

4 Real Time PCR Real Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut (Fatimi 2010). Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk menghitung jumlah kopi DNA atau threshold cycle (Ct) dari patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).

5 Berdasarkan uraian diatas maka dapat diidentifikasi masalah yaitu sejauh mana potensi dan tingkat serangan kepiting sebagai carrier dalam penginfeksian penyakit White Spot Syndrome Virus pada udang windu dengan menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR IDENTIFIKASI MASALAH Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi White Spot Syndrome Virus yang terbaik pada kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi udang windu dengan menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR. TUJUAN PENELITIAN Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada petambak udang windu tentang potensi kepiting yang merupakan carrier WSSV yang menyerang udang windu sehingga petambak dapat mengantisipasi secara dini penyakit WSSV. KEGUNAAN PENELITIAN

6 Pendekatan Masalah... Budidaya Udang Windu Mengalami penurunan produksi Penurunan mutu lingkungan Serangan penyakit Hama Organisme carrier Kepiting PCR Konvensional Real Time PCR Deteksi Hasil Penelitian

7 Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR. Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji Nested PCR. Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per rekasi. Pada pengujian 1 sampai 10 8 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 10 4 kopi/µg DNA.

8 TEMPAT Pengambilan sampel dilakukan di tambak udang windu di Kecamatan Indramayu dan Pasekan Kabupaten Indramayu. Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Pemeriksaan dengan PCR konvensional dan pemeriksaan dengan real time PCR dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Balai Uji Standar Karantina Ikan Jakarta WAKTU Penelitian ini dilaksanakan pada Bulan Mei sampai Juli 2012.

9 Alat-Alat Penelitian Botol plastik, cool box Pengambilan Sampel Autoclave, Analytical balance, gunting, pinset, sumpit plastik, mikrotube 1,5 ml, rak mikrotube, centrifuge, refrigerator, waterbath, vortex, mikropipet, mikrotips, timer,, sarung tangan, spidol marker Isolasi PCR Chamber, GeneAmp PCR System 9700, Mesin Rotor-Gene Q yang dihubungkan dengan perangkat komputer, vortex, microcentrifuge, deep freezer, mikrotube 0,2 ml dan 0,5 ml, mikropipet, mikrotips, cooler block, beaker glass, sarung tangan Amplifikasi Bejana elektroforesis dilengkapi dengan power supply, tangki, sisir, tutup, Analytical balance, Botol Scott, Gelas ukur ukuran 50 ml, corong, microwave, Ultraviolet illuminator, sendok kecil, mikropipet, mikrotips, waterpass, cooler block, parafilm, sendok pipih, refrigerator, kamera digital, sarung tangan Elektroforesis

10 BAHAN-BAHAN PENELITIAN Pengambilan Sampel Larutan Preservasi Alkohol : Gliserol (4:1) Es Curai Isolasi Sampel kepiting Nuclei Lysis Solution 0,5M EDTA pH 8,0 Proteinase K RNase Solution Protein Precipitation Solution Isopropanol Ethanol 70% DNA Rehydration Solution Es curai Amplifikasi Promega Go Taq® Green Master Mix Plasmid (+) standar sebagai kontrol positif WSSV Nuclease Free Water (NFW) Primer WSSV 270 dan WSSV 345 DNA template Elektroforesis Agarose TAE (Tris Acetic Acid EDTA) Buffer 50X Sybr Safe Loading Dye DNA Marker Ethidium Bromide (EtBr) Aquadest Steril Amplifikasi dengan Real Time PCR Rnase-free water, 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix Primer WSSV 270 dan Primer WSSV 345 Probe WSSV 296T Standar Positif (+) WSSV 2 x 10 5 DNA template Metode PCR Konvensional Metode Real Time PCR

11 METODE PENELITIAN Metode penelitian yang digunakan adalah metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan analisis data.

12 PROSEDUR PENELITIAN Setting Profil PCR Preparasi Reagen PCR Proses Real Time PCR Interpretasi Data Amplifikasi Pengambilan Sampel Isolasi Pemeriksaan dengan Real Time PCR Pemeriksaan dengan PCR Konvensional Analisis Data Elektroforesis Kepiting sebanyak 7 ekor dari setiap lokasi tambak

13 8,5µl NFW x (jumlah sampel + 2)* 1µl F1 x (jumlah sampel + 2)* 1µl R1 x (jumlah sampel + 2)* 12,5µl Master Mix x (jumlah sampel + 2)* 23µl 2 µl template DNA sampel 2 µl plasmid + sebagai kontrol positif Kontrol Negatif First Step PCR

14 ELEKTROFORESIS Pembuatan Gel Agarose Loading Hasil Amplifikasi PCR Running Elektroforesis Dokumentasi Gel dengan UV

15 Stok µl + 9µl NFW 23µl 2 µl NTC 2 µl template DNA sampel 2 µl plasmid kontrol µl plasmid kontrol µl plasmid kontrol Pengenceran Standar Positif Pembuatan Campuran Reaksi Real Time PCR 9 µl Rnase-free water x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Primer WSSV270 x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Primer WSSV345 x (jumlah sampel + 4)* µl 2x QuantiTect Probe PCR Master Mix x (jumlah sampel + 4)* 0.5µl Probe WSSV296T x (jumlah sampel + 4)* 2 µl template DNA sampel

16 Analisa Data... Data yang diperoleh dari hasil penelitian akan dianalisis secara deskriptif kualitatif yaitu membandingkan hasil DNA WSSV yang terdeteksi dengan menggunakan metoda PCR Konvensional dan Real Time PCR.

17 HASIL DAN PEMBAHASAN Pengamatan Gejala Klinis Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional Hasil Deteksi Wssv Dengan Real Time PCR Perbandingan Hasil Deteksi PCR Konvensional Dan Real Time PCR

18 PENGAMATAN GEJALA KLINIS LokasiOrganismeJumlah (ekor) Pasekan Scylla serrata2 Helice tridens1 Pachygrapsus marmoratus4 Karangsong Helice tridens4 Ocypode quadrata 1 Uca minax 2 Total14 Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis terserang virus white spot, yaitu adanya bintik putih pada bagian tubuh.

19 Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom Sampel Panjang Gelombang (nm) Konsentrasi/ C (ng/µl) Rasio Absorbansi (R) A260A280 Pachygrapsus marmoratus (A1)0,0310, ,583 Pachygrapsus marmoratus (A2)0,0390, ,167 Pachygrapsus marmoratus (A3)0,0010, ,111 Pachygrapsus marmoratus (A4)0,1330, ,797 Scylla serrata (B1)0,0210, ,000 Scylla serrata (B2)0,0670, ,914 Helice tridens (C1)0,0160, ,000 Helice tridens (D1)0,2000, ,802 Helice tridens (D2)0,1090, ,180 Helice tridens (D3)0,3540, ,967 Helice tridens (D4)0,1150, ,170 Uca minax (D5)0,0990, ,152 Ocypode quadrata (D6)0,0590, ,269 Uca minax (D7)0,0640, , SPEKTROFOTOMETER ELEKTROFORESIS

20 1 Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional : M= Marker 100 bp DNA Ladder9= Sampel C1 Helice Tridens 1= Kontrol Positif (76 bp)10= Sampel D1 Helice Tridens 2= Kontrol Negatif11= Sampel D2 Helice Tridens 3= Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)12= Sampel D3 Helice Tridens 4= Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)13= Sampel D4 Helice Tridens 5= Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus (76 bp)14= Sampel D5 Uca minax 6= Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus15= Sampel D6 Ocypode quadrata (76 bp) 7= Sampel B1 Scylla serrata (76 bp)16= Sampel D7 Uca minax (76 bp) 8= Sampel B2 Scylla serrata (76 bp) Keterangan : M

21 Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR Pengenceran Standar Kurva Kurva standar sampel asal tambak Pasekan memiliki nilai slope - 4,45724, nilai efisiensi 67,63% dan nilai R 2 mencapai Adapun persamaan garis dari kurva standar yaitu y = x dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang diuji. y = x Kurva standar sampel sampel asal tambak Karangsong memiliki nilai slope , nilai efisiensi 64,15% dan nilai R 2 mencapai Persamaan garis dari kurva standar yaitu y = x dengan y adalah nilai Ct dan x adalah log konsentrasi virus yang diuji.

22 Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan Keterangan : 6 Sampel positif WSSV 1 Sampel negatif WSSV

23 Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong Keterangan : 6 Sampel positif WSSV 1 Sampel negatif WSSV

24 PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR Keterangan : 12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV) 2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV No. Kode Sampel SpesiesPCR Konvensional* Real Time PCR Nilai Ct Jumlah Kopi WSSV 1. Kontrol +Std wssv 2 x , Kontrol +Std wssv 2 x , Kontrol +Std wssv 2 x , A1Pachygrapsus marmoratusPositif A2Pachygrapsus marmoratusPositif A3Pachygrapsus marmoratusPositif A4Pachygrapsus marmoratusNegatifPositif B1Scylla serrataPositif B2Scylla serrataPositif C1Helice tridensNegatif D1Helice tridensNegatifPositif D2Helice tridensNegatif D3Helice tridensNegatifPositif D4Helice tridensNegatifPositif D5Uca minaxNegatifPositif D6Ocypode quadrataPositif D7Uca minaxPositif

25 KESIMPULAN DAN SARAN KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : 1.Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinis dibandingkan dengan PCR konvensional. 2.Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah Pachygrapsus marmoratus, Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax. 3.Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76 bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu. 4.Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan Indramayu. SARAN Berdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis, serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.

26 TERIMA KASIH


Download ppt "SIDANG KOMPREHENSIF RINA NOVITA PRANAWATY NPM. 230110080062 APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google