IDENTIFIKASI LANGSUNG RESIDU GlcNAc NON PEREDUKSI PADA GLIKOPROTEIN N-GLIKAN MENGGUNAKAN METODE KEMOENZIMATIK BARU Pasjan Satrima Fitrah (20507007) Direct.

Presentasi berjudul: "IDENTIFIKASI LANGSUNG RESIDU GlcNAc NON PEREDUKSI PADA GLIKOPROTEIN N-GLIKAN MENGGUNAKAN METODE KEMOENZIMATIK BARU Pasjan Satrima Fitrah (20507007) Direct."— Transcript presentasi:

1 IDENTIFIKASI LANGSUNG RESIDU GlcNAc NON PEREDUKSI PADA GLIKOPROTEIN N-GLIKAN MENGGUNAKAN METODE KEMOENZIMATIK BARU Pasjan Satrima Fitrah ( ) Direct Identification of Nonreducing GlcNAc Residues on N-Glycans of Glycoproteins Using a Novel Chemoenzymatic Method Elizabeth Boeggeman,†,‡ Boopathy Ramakrishnan,†,‡ Charlton Kilgore,† Nelly Khidekel,^ Linda C. Hsieh-Wilson,^ John T. Simpson,§ and Pradman K. Qasba*,† Structural Glycobiology Section, CCR-Nanobiology Program, Center for Cancer Research, NCI-Frederick, and Protein Chemistry Revised Manuscript Received January 8, 2007

2 Glycosyltransferases
Glycosyltransferases, is involved in the assembly of oligosaccharide chains, each enzyme transferring a monosaccharide moiety of an activated sugar donor to an oligosaccharide acceptor molecule often require a metal ion cofactor

3 grouped into families based on the type of sugar they transfer (eg, galactosyltransferase, fucosyl transferase,sialyltransferase, polypeptide-N-acetylgalactosaminyltransferase,O-xylosyltransferase,blood group A and B transferases Each transferase generates a specific linkage with a specific acceptor.

4 Alterations in glycosyltransferase activities that result in the defective glycan synthesis have been shown to have serious pathological consequences leading to several human diseases

5 General Structural Features of Glycosyltransferase (an overview)
The long flexible loop (orange loop, residues Ile345-His365) and the small flexible loop (yellow, residues Gly313-Gly316) are in closed conformation. The Trp314 (W314) side chain is facing toward the binding pocket that is interacting with UDP-Gal. The 3 protein ligands, Asp (D254), Met (M344), and His (H347), the 2 phosphate oxygens (red balls), and 1 molecule of water (yellow ball) participate in the coordination of Mn2+. The acceptor binding site (shown with arrow) involves 2 Tyr residues, Y289 and Y286, and Phe (F360). The enzyme can be considered as a 2-domain protein, one α-helix rich and the other β-sheet rich, with substrates binding between the domains. Molecular structure of β4Gal-T1 in closed conformation, in complex with UDP-Gal and Mn2+.

6 Enzim glycosyltransferase spesifik mengkatalisis penambahan residu gula

7 GLIKAN polysaccharide or oligosaccharide.
Glycan may also be used to refer to the carbohydrate portion of a glycoconjugate, such as a glycoprotein, glycolipid, or a proteoglycan.

8 Golongan darah ABO ditentukan oleh dua jenis glycosyltransferases

9 Lektin Reseptor membran
Mengenali dan mengikat residu gula oligosakarida Ligan karbohidrat berfungsi sebagai shuttle small drug molecule, protein dan bahkan DNA.

10

11 Tujuan Penelitian Membuat mutant 1,4-galactosyltransferase ( 4Gal-T1),  4Gal-T1-Y289L, 1) yang dapat mentransfer GalNAc dari donor gula UDP-GalNAc ke akseptor, GlcNAc 2) yang dapat mentransfer gula termodifikasi (C2 keto galactosa) dari UDP sehingga memberikan metode kemoenzimatik yang sangat sensitif Mengidentifikasi langsung hasil transfer dengan MS MALDI dan Chemiluminescense.

12 Manfaat Penelitian Aplikatif dalam glikotargeting obat

13 Metodologi Penelitian
Penyiapan dan pemurnian WT dan Mutan Uji Enzim GalNAc-T Transfer C2 Keto Galaktosa dari turunan UDP ke residu GlcNAc bebas pada glikoakseptor menggunakan enzim mutan Biotinilasi Ovalbumin dan IgG1. Western Blotting Ovalbumin dan IgG1 Peptida : Perlakuan dengan N-glikosidaseF Analisis MS MALDI

14 Penyiapan Enzim WT & Mutant
E. coli BL21(DE3) Ekspresi pET23a BL219DE3)pLysS Isolasi Pemurnian Analisis

15 GalNAc-T Assay UDP-GalNAc sebagai donor nukleotida
Dengan berbagai konsentrasi dari : Akseptor GlcNAc Chitobiose Chitoteriose Chitotetrose Mono,di-,tri-,tetrasakarida

16 * Ovalbumin atau asialo-agalakto-IgG1
Transfer C2 Keto Galaktosa dari turunan UDP ke residu GlcNAc bebas pada glikoakseptor menggunakan enzim mutan SAMPEL* 1mM UDP-C2 Keto galaktosa 500 ng Mutan 4Gal-T1-Y289L 10 mM MnCl2 25 mM tris-HCl (pH 8.0) Campuran Diinkubasi pada 30 oC selama 3 jam * Ovalbumin atau asialo-agalakto-IgG1

17 N-Aminooksimetilkarbonilhidroksino-D-biotin
Biotinilasi Ovalbumin dan IgG1. Protein with labeled keton campuran NaOAc 50 mM pH 3.9 dan N-Aminooksimetilkarbonilhidroksino-D-biotin Inkubasi 25 oC 12-16 jam SDS PAGE

18 Western blotting ovalbumin dan asialo-agalakto-IgG1

19 Perlakuan dengan N-glikosidaseF
Peptida : Perlakuan dengan N-glikosidaseF SAMPEL* 3 g Dididihkan selama 10 menit dalam SDS loading buffer 1 % dan  merkaptoetanol 1 % Diinkubasi dengan atau tanpa PNGase,16 jam 37 oC dalam dapar Natrium fosfat 5 mM dan NP-40 1% Didihkan dan dipisahkan dalam SDS PAGE HASIL * Ovalbumin atau asialo-agalakto-IgG1

20 Hasil dan Pembahasan

21 aß4Gal-T1-Y289L mutan diuji pada konsentrasi akhir 24 mg/ml
aß4Gal-T1-Y289L mutan diuji pada konsentrasi akhir 24 mg/ml. Uji dilakukan pada 30oC dengan inkubasi semalaman menggunakan UDP-GalNAc 1,5 mM dan akseptor 1 mM. bSubstrat pentasakarida [GlcNAc ß 1,2-Mana1,6-(GlcNAc ß 1,2-Mana1,3)-Man] dan substrat heptasakarida tetrapeptida [Arg-[GlcNAc ß 1,2-Mana1,6-(GlcNAc ß 1,2-Mana1,3)-Man ß 1,4-GlcNAcb1,4-GlcNAcß]-Asn-Glu-Gly] merupakan struktur bercabang mempunyai 2 mol GlcNAc per mol substrat untuk reaksi pemindahan. cGalNAc dipindahkan hanya 50% dari residu GlcNAc yang tersedia dalam struktur substrat bercabang. dOvalbumin mempunyai N-linked glikan bercabang. Jumlah GlcNAc untuk dipindahkan bervariasi. ePersentase akseptor yang diubah menjadi produk dihitung berdasarkan jumlah ovalbumin yang digunakan dalam pengujian.

22 GlcNAc GalNAc Mannose 2’ C2 Keto Galaktose Penentuan spektrum MS sebelum dan sesudah perlakuan dengan UDP-GalNAc dan UDP-Gal termodifikasi C2 Keto Chitotetrose Branched Heptasakarida

23 Glikan yang dilepaskan dari ovalbumin ayam sebelum transfer GalNAc
Glikan yang dilepaskan dari ovalbumin ayam setelah transfer GalNAc

24 Spesifitas Donor Gula  4Gal-T1-Y289L
Mutasi Tyrosin 289 menjadi Leusin 289 mengubah spesifitas enzim

25  (A) Schematics of the transfer of a modified sugar by the mutant β-1,4-galactosyl-transferase, Y289L-Gal-T1, to N-acetylglucosamine moiety of a glycoconjugate. (B) Coupling of the modified sugar residue with an aminooxy-linker.

26 Pemindahan turunan C2 keto ke residu GlcNAc bebas pada rantai N-glikan ovalbumin oleh enzim mutan b4Gal-T1-Y289L. (A) Galaktosa C2 keto dipindahkan ke residu GlcNAc pada ujung non pereduksi dari rantai glikan, oleh enzim mutan b4Gal-T1-Y289L

27 Deteksi kemoenzimatik dari turunan C2 keto yang dipindahkan

28 Western Bloting... (A) Diagram skema molekul IgG dengan struktur N-glikan menempel pada daerah Fc.

29 (B) Moiety galaktosa C2 keto dipindahkan ke karbohidrat dalam daerah Fc dari IgG, menggunakan enzim mutan  4Gal-T1-Y289L. Campuran tanpa PNGase F (-) dan dengan PNGase F (+) mengandung NP-40, untuk kopling dengan biotin aminooksi. Campuran dipisahkan dengan SDS-PAGE, dipindahkan oleh Western blotting ke membran nitroselulosa dan ditandai dengan streptavidin-HRP. Khemiluminesensi tidak terdeteksi pada sample dengan perlakuan PNGase F (+) menunjukkan bahwa pemindahan moiety galaktosa C2 keto termodifikasi adalah selektif untuk bagian glikan dari IgG1 dan glikosilasi terjadi pada rantai berat IgG1 pada residu GlcNAc bebas (10, 25 dan 50 ng).

30 Kesimpulan Wild Type hanya bisa mentransfer Gal
Mutan dapat mentransfer Gal dan GalNAc Hasil Transfer GalNAc dapat dibuktikan dari hasil analisis MS Spektroskopi dan Chemiluminescense Efisiensi transfer GalNAc hampir 100 % pada oligosakarida linear sedangkan yang bercabang hanya 50 %. ovalbumin, efisiensi transfer GalNAc hanya 37%

31 Mutan glikosiltransferase digunakan untuk glikotargeting obat pada sisi aktifnya, yaitu reseptor asialoglikoprotein.

32 References Boeggeman, 2007, Direct Identification of Non reducing GlcNAc residues on N-Glicans of Glicoprotein Using a Novel Chemoenzymatic Method, Bioconjugate Chem, Center for Cancer Research. Boeggeman, 2006, Mutant Glycosyltransferases Assist in the Development of a Targeted Drug Delivery System and Contrast Agents for MRI, AAPS Journal, Basic Research Program, SAIC-Frederick Inc, Frederick, MD zrw.web.psi.ch/.../novak/antibody.htm