Transformasi tanaman obat Hyocyamus muticus penghasil alkaloid tropane dengan penembakan partikel Hakim H.K Nurul Fazri Rahmi Fitriana

Abstrak Kami melaporkan sistem transformasi seluruh tanaman yang efisien untuk hyocyamus muticus, merupakan tanaman obat yang penting dari keluarga solanaceous. Kami mengembangkan sistem menggunakan plasmid membawa nptII dan gen gusA , yang disampaikan ke eksplan daun dengan penembakan partikel. Sepuluh persen dari dibombardir eksplan daun terbentuk tahan kanamisin kalus , dari mana tanaman transgenik putatif itu ditemukan. Gen nptII resistansi kanamisin ditemukan dimasukkan ke dalam genom semua tanaman transgenik disaring. Lebih dari 50% dari tanaman yang tahan kanamisin menunjukkan ekspresi yang kuat dari gen gusA yang tidak dipilih. Mayoritas tanaman transgenik jatuh tempo, dapat melalukan penyerbukan sendiri, dan menghasilkan biji subur. Sebuah sistem transformasi seluruh tanaman sederhana dan efisien untuk tanaman obat ini merupakan langkah penting dalam memajukan pemahaman kita dalam produksi alkaloid tropane pada tanaman.

Hyocyamus muticus spp Umumnya dikenal sebagai semacam tumbuhan, juga dikenal sebagai nightshade bau atau semacam tumbuhan hitam, adalah tanaman dari keluarga Solanaceae yang berasal dari Eurasia, meskipun sekarang didistribusikan secara global. Tumbuhan penghasil bahan obat-obatan yang telah dikenal sejak ribuan tahun. Sebagai anggota suku Solanaceae, tumbuhan ini masih sekerabat dengan datura, tumbuhan hias dengan bunga berbentuk terompet yang besar. Kecubung biasanya berbunga putih dan atau ungu, namun hibridanya berbunga aneka warna. Sumber: http://www.riyawan.com/2014/07/hyoscyami.html#.VDy3 3dmULDc

Hyocyamus muticus

Diperkirakan tanaman ini pertama kali dipakai sebagai obat-obat pada abad kesepuluh. Kecubung ada yang berasal dari Asia Tenggara, namun ada juga yang berasal dari Benua Amerika. Kecubung tumbuh di tempat yang beriklim panas dan dibudidayakan di seluruh belahan dunia karena khasiat yang dikandungnya dan juga untuk tanaman hias. Pertama kali diperkenalkan oleh Linnaeus pada tahun 1753, tapi secara botani masih belum tepat mengenai gambaran dan penjelasan tentang kecubung. Wilayah asal yang menjadi sumber tanaman ini tidak dapat diketahui secara pasti. Bagian-bagian kecubung, tetapi terutama bijinya, mengandung alkaloid yang berefek halusinogen.

Saat ini satu-satunya sistem transformasi seluruh tanaman tersedia untuk hyocyamus spp. adalah Agrobacterium Transfer rhizogenes dimediasi gen ke hyocyamus muticus (sevon et al., 1995). Namun, sistem ini memiliki keterbatasan terkait dengan manipulasi alkaloid metabolisme karena A. rhizogenes gen rol memiliki terbukti mempengaruhi metabolisme alkaloid tropane. Gen rol muncul untuk meningkatkan produksi alkaloid dalam akar rambut sambil menghambat produksi alkaloid dalam seluruh tanaman (sevon et al., 1997). Penggunaan A. rhizogenes jelas bermasalah untuk penelitian masa depan pada manipulasi jalur metabolik sekunder karena sulit untuk memantau efek disebabkan oleh gen Agrobacterium dan yang disebabkan oleh manipulasi genetik.

Kami menemukan bahwa penembakan partikel pada eksplan daun adalah prosedur yang lebih sederhana dan efisien untuk transformasi H. muticus. Produksi kalus tahan kanamisin transgenik terjadi mudah dengan pemboman. Tidak seperti Nicotiana tabacum (Leech et al., 1998) H. muticus tidak membentuk tunas langsung dari pemboman eksplan daun, meskipun plantlets H. muticus pulih dari kalus dengan efesiensi yang tinggi.

Bahan & Metode Plants Material & Tissue Culture Hyocyamus muticus L. (strain Kairo, Solanaceae) tanaman ditanam di rumah kaca di bawah lampu natrium untuk mempertahankan 16-h panjang hari minimum, dan dengan rezim suhu 24°C/20°C hari/malam. Daun muda dikumpulkan dan disterilkan dalam larutan 10% pemutih rumah tangga (Vortex, Proctor & Gamble, UK) selama 15 menit. Setelah mencuci menyeluruh dalam air steril, daun dipotong menjadi 0,5 cm2 kotak, menghindari pembuluh darah, dan ditempatkan pada media MS (Murashige & Skoog, 1962) ditambah dengan 3% sukrosa dan 0,8% Difco bacto agar. Mereka diinkubasi pada 25°C selama 1 hari sebelum pengeboman (12jam penyinaran, 2600 lux).

Vektor transformasi dan penembakan partikel Plasmid digunakan untuk partikel pemboman (PNP GUS, Gambar 1) mengandung gen nptII, yang memberikan resistensi kanamisin, dan Escherichia coli gusA encoding gen reporter b-glucuronidase (GUS). Struktur konstruk adalah sebagai berikut: CaMV 35S Promotor: Pemimpin amv: gusA: NPA + nopaline synthase (NOS) -promoter: nptII: NPA. Plasmid DNA untuk penembakan partikel diisolasi dari rekombinan E. coli

Setelah pemboman, eksplan daun diinkubasi pada 25 C selama 24 jam dalam gelap. Eksplan kemudian dipindahkan ke medium basal MS yang mengandung 3% sukrosa, 0,8% agar dan ditambah dengan 1-napthalene asam asetat (NAA; 2mg ml-1) dan 6 benzilamino purin (BAP; 0.5mg ml-1). Mereka diinkubasi selama 48 jam (12-h penyinaran) tanpa seleksi.seleksi dilakukan 72 jam setelah penembakan.

Pewarnaan histokimia GUS GUS aktivitas ditentukan dengan menggunakan alat tes histokimia (Jefferson et al., 1987). Bahan tanaman berada dibahan tanaman berada di cubated dalam buffer yang mengandung X-gluc pada 37 C selama 18 tangan destained selama 24 jam dengan 96% etanol. Ekspresi gusA Transient dinilai 24 jam setelah penembakan dengan menggunakan mikroskop stereo. Kegiatan GUS di tunas dianalisis dengan pewarnaan 2 Segmen daun 4mm dipotong dari tunas muda sebelum rooting. Tidak ada aktivitas GUS ditemukan pada tanaman kontrol atau eksplan (yaitu mereka tidak dibombardir dengan transformasi plasmid pNPT-GUS).

Analisis Southern blot Daun dikumpulkan dari tanaman yang telah tumbuh dalam rumah kaca selama 3 bulan. Genomic DNA diekstraksi dengan menggunakan Tanaman DNAzol Reagent (Gibco BRL Life Technologies, UK) dengan modifikasi berikut untuk instruksi dari pabriknya: bahan tanaman diinkubasi selama 30 menit, dengan reagen DNAzol, dan langkah tambahan akhir dilakukan di mana DNA diendapkan dengan etanol dan spooled

(A) transformasi Seluruh tanaman dan sistem regenerasi untuk H. muticus. (B) histokimia pewarnaan dibombardir eksplan daun menunjukkan aktivitas GUS transien pada kecepatan pemboman yang berbeda (tekanan helium setara dalam psi). (C) Kalus yang muncul dari dibombardir eksplan setelah 6 minggu pada medium induksi kalus. (D) Tembak regenerasi dari kalus 2-3 bulan setelah subkultur pada media regenerasi. (E) tunas regenerasi pada media auksin. (F) pembentukan akar oleh regenerasi tunas 1-3 bulan setelah transfer ke media perakaran. (G) histokimia pewarnaan daun yang terluka dari tanaman transgenik menunjukkan aktivitas GUS. (H) histokimia pewarnaan untuk kegiatan GUS tanaman regenerasi pada tahap ketika pot ke dalam tanah berlangsung (4-10 bulan setelah pemboman).

Hasil & DIskusi