Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Kelompok 10 Raditya Rainer C Yongki Republik Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Kelompok 10 Raditya Rainer C Yongki Republik Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat."— Transcript presentasi:

1 Kelompok 10 Raditya Rainer C Yongki Republik Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat

2 Isolasi Papain Getah pepaya dikumpulkan dengan konvensional digunakan sebagai bahan baku utama papain

3 Bahan Pohon pepaya lokal Standard papain, polyacrylamide, bis-acrylamide, ammonium persulfate and PEG 6000 Sigma–Aldrich (St. Louis, USA), Casien (Hammarsten) BDH (Poole, Eng-land).

4 Isolasi Getah Latex atau getah diisolasi dari pohon pepaya Getah dikumpulkan dengan perangkat yang terpasang pada batang pohon Getah disimpan dalam botol plastik pada suhu C

5 Purifikasi Papain Salt precipitation (pengendapan garam) 2 tahap Aqueous two-phase system (sistem dua fase)

6 Salt precipitation 1 Getah dicampur dengan cystein dengan perbandingan 3:1 (w/v) disuspensi dengan 6M HCl samapi pH 5.6 dan diaduk dengan stirer 15 menit pada 4 0 C Hasil larutan ditambahkan 6M NaOH sampai pH 9 Zat yang tidak larut dihilangkan dengan sentrifugasi 9000 g 30 menit, 4 0 C Supernatant diambil ditentukan kandungan protein

7 Salt precipitation 2 Supernatan dinetralkan dengan penambahan air Pengendapan dengan menambahkan (NH 4 ) 2 SO 4 kemudian diaduk dengan stirrer pada suhu 4 0 C selama 30 menit Sentrifugasi 9000 g 30 menit, 4 0 C Pesipitat diambil ditambahkan 20mM cystein Larutan dijaga 4 0 C kemudian ditambahkan 10%NaOH (w/v) distirrer selama 30 menit Sentrifugasi untuk memisahkan padatan papain Padatan dilarutkan dalam air dan didialisis pada 4 0 C dengan tiga kali pergantian air (1 L) Endapan yang didapatkan berupa enzim papain, di lyophilized (freeze –dryer) maka didapatkan powder papain

8 Salt precipitation Penambahan air Sentrifugasi (Supernatan) Penambahan (6 M NaOH) Pengaturan pH (6M HCl) Pelarutan dengan cystein Freeze dry (Powdwer papain) Dialisis dengan air Penambahan NaOH (sentrifugasi) Penambahan cyctein Sentrifugasi (Presipitat) Pengendapan dengan (NH4)2SO 4

9 Extraction in aqueous two-phase system Getah dicampur dengan air dan pH diatur dengan 6M HCl. Ekstraksi dua fase diperlukan penambahan PEG (Polietilen Glikol) dan (NH 4 ) 2 SO 4 pada getah ( 30 gr getah) Hasil pencampuran ditambahkan air sampai dengan 50 gr, pH diatur dengan menambahakan 6M HCl atau 6 M NaOH Larutan diaduk selama 15 menit dengan perlahan. Kedua fase yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi 9000 g selama 30 menit pada 4 0 C Aliquot diambil untuk dianalisis protein dan aktifitas protease. Keberadaan papain dalam fraksi ditentukan dengan analisis gel elektrophoresis katode dan FPLC

10 Extraction in aqueous two-phase system Analisis dengan FPLC, fraksi atas sebanyak 6 ml dari larutan didialisis tiga kali pada 4 0 C dengan 50 mM sodium asetat buffer pH 5 PEG dipisahakan dari larutan dengan Chromatografi ion- exchange Larutan dimasukan dalam kolom CM-selulosa (1.5 cm x 2cm) diequiliberasi dengan 50 mM asetat buffer pH 5 Enzim dielusi dari kolom dengan buffer NaCl 1 M Papain sebagaian besar terelusi didepan kedua buffer Fraksi ini dikumpulkan, didialisis dan lyophilized (freeze dryer) didapatkan powder papain

11 Aqueous two-phase system Fraksi atas didialisis sodium asetat Aliquot dianalisis Sentrifugasi (fraksi) Penambahan PEG (Polietilen Glikol) dan (NH4)2SO 4 Penambahan air dan Pengaturan pH (6M HCl) Freeze dryer (powder papain) Fraksi dikumpulkan NaCl Buffer Asetat buffer Kolom CM-Selulosa PEG dipisahkan kromatografi ion exchange

12 Analisis kemurnian dengan Fast Protein Liquid Chromatography 25 µl larutan papain dalam 20 mM glycine-NaOH buffer digunakan di dalam kolom Mono Q HR 5/5 (1 ml) yang di cuci dengan 5 ml buffer yang sama Papain dan protein lainnya terelusi oleh gradien linear sodium klorida dari 0 – 0,5 M (total volume 24 ml) dengan laju 1,0 ml/min Fraksi 1 ml di ambil dan diplot kromatografi A280 dan komposisi gradien vs volume elusi direcord Peak elusi dari papain ditentukan menggunakan papain standar Persentase luas peak papain didapatkan dari automatic integrator Kemurnian papain diketahui dari persentase luas peak papain berbanding luas peak total

13 Analisis aktifitas enzim papain 100 µl larutan enzim dipreparasi dahulu dengan dicampurkan 200 µl 50 mM cysteine-20 mM EDTA dan 700 µl 50 mM Tris-HCl buffer pada pH 8 Campuran tersebut diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C direaksikan dengan 1 ml 1% (w/v) larutan casein Setelah 10 menit, reaksi dihentikan dengan menambahkan 3 ml 5% (v/v) trichloroacetic acid (TCA) pada larutan tersebut dan didinginkan selama 1 jam Campuran itu kemudian disentrifugasi dan diambil supernatannya untuk diukur absorbansinya pada 275 nm Satuan unit aktifitas protease tersebut diukur berdasarkan jumlah enzim yang memberikan produk digesti terlarut yang menghasilkan kenaikan absorbansi pada 275 nm setara dengan 1 µmol dari tyrosine/min pada kondisi percobaan

14 Papain assay Gel Elektrophoresis katode-polyacryamide 1.Standar Papain 2.Crude Latex 3.Salt precipitate 4. Fraksi atas 2 phase aqueous 5. Fraksi bawah Bottom

15 Salt precipitation

16 Aqueous two-phase system

17 Hasil Papain Papain murni didapatkan pada fase atas FPLC dengan 1/4 volume dari keseluruhan Optimal precipitation dan two phase sistem purity (100% versus ∼ 89%) dari papaya latex.

18 FPLC

19 Estimasi Kasar Ekonomi Analisis Harga peralatan Analisis FPLC : $3500 Gel Elektrophoresis katode-polyacryamide : $2500 Harga papain 37.5 euro/ 225 gr

20 Ekonomi Analisis Papain Enzyme Dietary Supplement Concentrate The product is standardized 400 MCU/ gram Bulk Food Grade USP Powder Packaging: 225 grams Price $37.25 ea.

21 Spesifikasi Papain Papain adalah cysteine protease daripeptidase (C1 family). Papain terdiri atas sebuah rantai polypeptide dengan tiga ikatan disulfida dan a sulfhydryl group sebagai pengaktif enzyme. Spectral properties: λ max : 278 nm Extinction coefficient, E 1% = 25 Extinction coefficient, EmM = 57.6 (at 280 nm) Definisi Unit: 1 unit menghidrolisis 1.0 µmole of N- α -benzoyl-L-arginine ethyl ester (BAEE) per menit pada pH 6.2 suhu 25 °C. Berat Molekul : 23,406 Da (amino acid sequence) Optimal pH for activity : Temperature Optimum : 65 °C Sigma Alderich


Download ppt "Kelompok 10 Raditya Rainer C Yongki Republik Bioseparasi Papain sebagai bahan baku obat."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google