Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Nanda Aryani Sabir Anggraeni Ramadhaleta Ida Ayu Suci Hanifullah Habibi OLEH : Protease Inhibition Assays.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Nanda Aryani Sabir Anggraeni Ramadhaleta Ida Ayu Suci Hanifullah Habibi OLEH : Protease Inhibition Assays."— Transcript presentasi:

1 Nanda Aryani Sabir Anggraeni Ramadhaleta Ida Ayu Suci Hanifullah Habibi OLEH : Protease Inhibition Assays

2 Pendahuluan Penyakit Protease fisiologis sel kontrol tekanan darah respon imun pencernaan pembekuan darah Kanker, emfisema paru, dystrophy otot, arthritis, pankreatitis

3

4

5

6 Jumlah kromofor bebaskan sebanding dengan aktivitas enzim PRINSIP ESAI Substrat kromogenik protease memiliki urutan asam amino spesifik yang terikat dengan kromofor seperti p-nitroaniline Aktivitas spesifik protease terhadap substrat menyebabkan pelepasan kromofor yang diukur sebagai peningkatan absorbansi dalam spektrofotometer

7 BAHAN DAN ALAT BAHAN  HCl 5 M  Buffer Tris-HCl kons. 50 mM pH 8.6  Buffer Tris-HCl 0,4 M pH 8.6  Enzim Elastase  DMSO  Air bebas ion  Substrat: Suc (Ala) 3 -p-nitroanilide kons  Sampel uji: Senyawa X ALAT  Pipet mikro  Labu takar  Gelas beaker  pH meter  Spektrofotometer UV-Vis  Tabung Eppendorf  Plat mikro 96 sumur (flat bottom)  Timer

8 PROSEDUR ESAI

9 gram Tris (hydroxymethyl)- aminomethane 1. Buffer Tris-HCl Air bebas ion HCl 5 M, pH larutan menjadi 8.6 Larutan stok 10 mL

10 PROSEDUR ESAI Pengenceran untuk 36 x uji 2. Buffer Tris-HCl 0,4 M Ulangan Variasi Konsentrasi Total Esai Kontrol Positif ( buffer+enzim+ ONO-6818+Substrat ) 3515 Bahan uji ( buffer+E+Ekstrak Kerang Lunak+S )3515 Blanko (buffer, enzim, DMSO+S)313 Kontrol Negatif (S+Buffer+E+DMSO)313 TOTAL36

11 2. Buffer Tris-HCl 0,4 M Volume esai buffer untuk 36 x uji 36x 50 µL = 1,8 mL (1800 µL) Larutan stok dibuat sebanyak 10 mL diambil dari larutan stok 5 M. Sehingga volume larutan stok yang diencerkan sebanyak : V1.M1 = V2.M2 V1 = (10 mL x 0,4 M) / 5 M = 800 μL atau 0.8 mL PROSEDUR ESAI

12 2. Buffer Tris-HCl 50 mM Volume esai buffer untuk 36 x uji Untuk membuat larutan Tris HCl 50 mM dalam 10 mL dibuat dari larutan 1 M yang dibuat dari larutan induk 5 M. V1.M1=V2.M2V1= (10 mL X 1 M)/5 m V1= 2 mL 36x 50 µL = 1,8 mL (1800 µL) Larutan stok dibuat sebanyak 10 mL diambil dari larutan stok 1 M Sehingga volume larutan stok yang diencerkan sebanyak : V1.M1 = V2.M2 V1 = (10 mL x 50 mM) / 1 M = 0,5 mL PROSEDUR ESAI

13 3. Pembuatan Larutan Enzim Elastase 0,6 unit/mL Larutan Stok Enzim yang tersedia 6 unit/mL. V1.M1=V2.M2 V1=(0.6 u/mL x 2mL)/6 u/mL V1= 0.2 mL atau 200 μL 200 μL stok ditambahkan 1800 μL buffe r PROSEDUR ESAI

14 4. Pembuatan variasi konsentrasi sampel PROSEDUR ESAI Stok awal larutan sampel gr sampel dilarutkan dalam 1 mL DMSO Konsentrasi=1000 μg/mL. Diencerkan menjadi 200 μg/mL V1xM1=V2xM2 ; V1=(1000 mLx 200 μg/mL )/1000 μg/mL V1=200 μL larutan stok ditambah 800 μL buffer Variasi konsentrasi sampel 200;100;50;25;12,5 μg/mL Pengenceran bertingkat dilakuakan di dalam mikroplat sumur 96

15 4. Pembuatan variasi konsentrasi kontrol positif PROSEDUR ESAI Stok awal larutan sampel gr sampel dilarutkan dalam 1 mL buffer Konsentrasi=1000 μg/mL. Diencerkan menjadi 200 μg/mL V1xM1=V2xM2 ; V1=(1000 mLx 200 μg/mL )/1000 μg/mL V1=200 μL larutan stok ditambah 800 μL buffer Variasi konsentrasi sampel 200;100;50;25;12,5 μg/mL Pengenceran bertingkat dilakuakan di dalam mikroplat sumur 96

16 4. Pembuatan Larutan Substrat Suc-(Ala) 3-p-nitroanilide 1,55 mM massa substrat yang harus ditimbang adalah: massa= 6,9967 mg (dilarutkan dalam 10 mL buffer Tris-HCl ) PROSEDUR ESAI M= molaritas n= mol V= volume

17 Pengujian 96 well

18 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 100 µL DMSO MIX Inkubasi 37 o C, 30 menit 1 00 µL larutan substrat 15 menit Inkubasi 37 o C, 30 menit Absorban pada 410 nm Inkubasi 37 o C, 30 menit KONTROL NEGATIF

19 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 100 µL Larutan Ekstrak sampel dalam DMSO MIX Inkubasi 37 o C, 30 menit 1 00 µL larutan substrat 15 menit Inkubasi 37 o C, 30 menit Absorban pada 410 nm Inkubasi 37 o C, 30 menit BAHAN UJI

20 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 100 µL Substrat MIX Inkubasi 37 o C, 30 menit 1 00 µl ONO 15 menit Inkubasi 37 o C, 30 menit Absorban pada 410 nm Inkubasi 37 o C, 30 menit KONTROL POSITIF

21 50 µL assay buffer Tris HCl 0,4 M 50 µL larutan enzim protease 100 µl DMSO MIX Inkubasi 37 o C, 30 menit 1 00 µL larutan substrat 15 menit Inkubasi 37 o C, 30 menit Absorban pada 410 nm Inkubasi 37 o C, 30 menit BLANKO

22 Kalkulasi persentasi Penghambatan

23


Download ppt "Nanda Aryani Sabir Anggraeni Ramadhaleta Ida Ayu Suci Hanifullah Habibi OLEH : Protease Inhibition Assays."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google