UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

Analisa Karbohidrat Uji Kualitatif Uji Kuantitatif Uji Molisch Uji Seliwanoff Uji Anthrone Uji Benedict Uji Barfoed Uji Iodin Uji Pembentukan Osason Uji Fehling Uji Kuantitatif Cara Kimiawi Cara Enzimatis Cara kromatografi Cara Optic (fisis)

II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan , yaitu hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida. Hidrolisa Oligo / polisakarida  monosakarida (Pati) Asam atau enzim (glukosa) Penentuan monosakarida: kimiawi fisik enzimatik kromatografi

Metoda oksidasi dengan kupri Cara kimiawi Metoda oksidasi dengan kupri Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena adanya gula reduksi Reagen : - Reagen Luff (campuran CuSO4, Na2CO3, dan asam sitrat) - Reagen soxhlet (campuran CuSO4 dengan K – Na –tartrat) K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO4 dalam reagen

Penentuan kuprooksida yang terbentuk: Menimbang setelah dikeringkan kuprioksida  - sebagai oksidator - direduksi oleh gula reduksi membentuk kuprooksida (endapan merah bata) Penentuan kuprooksida yang terbentuk: Menimbang setelah dikeringkan Melarutkan kembali, kemudian dititrasi Menentukan selisih kuprioksida sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi Penentuan gula reduksi dalam larutan: Cara luff Schoorl Cara Munson Walker Cara Lane-Eynon

Cara Luff Schoorl Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi = (titrasi blanko – titrasi sampel) Reaksi : R – COH + CuO  Cu2O + R – COOH H2SO4 + CuO  CuSO4 + H2O CuSO4 + 2KI  CuI2 + K2SO4 2CuI2  Cu2I2 + I2 I2 + Na2S2O3  Na2S4O6 + NaI I2 + amilum : biru

Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis Dasar : reduksi ferisianida  ferrosianida oleh gula reduksi. 2K3Fe(CN)6 + 2KI  2K4Fe(CN)6 + I2 2K4Fe(CN)6 + 3 ZnSO4  K2Zn2[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4 gula reduksi ditentukan :  berdasar  I2  berdasar  NaS2O3 untuk titrasi Indikator : amilum (warna biru hilang) K4Fe(CN)6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara K3Fe(CN)6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi. Perlu dilakukan percobaan standarisasi

Metoda Iodometri Kelebihan I2 dititrasi dengan Na2S2O3 Reaksi : Sampel Spesifik untuk aldosa, ketosa hanya sedikit yang teroksidasi Harus dihilangkan zat yang dapat bereaksi dengan Iodin : etanol, aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format dan Urea

Laktosa secara kimiawi 25 ml susu + reagen  filtrat 5 ml filtrat + reagen  titrasi dengan Na2S2O3 100 A = (Tb – Ts) x N x 0,171 x  5 A = Kadar Laktosa (g/100 ml) Tb = titrasi blanko Ts = titrasi sampel Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5% dari 100 ml susu  48,4 ml filtrat 48,4 100 Kadar laktosa/100 ml susu = A x  x  100 25

Penentuan Sukrosa Langsung dengan Polirimeter/refraktometer Kimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi) C6H12O11 + H2O  C6H12O6 + C6H12O6 Sukrosa fruktosa glukosa (342) (180) (180)  Sukrosa = 0,95 x  gula reduksi  BM Sukrosa 342 FK =  =  2 BM gula reduksi 360 Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi dalam sampel sebelum hidrolisa.

Penentuan pati Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim  gula reduksi  ditera jumlahnya [C6H10O25] m + mH2O  m C6H12O6 pati glukosa BM = m.162 BM = 180 m BM pati FK =  m . BM gula reduksi m x 162 =  = 0,9 m x 180

Cara Enzimatis Terutama untuk penentuan gula dalam campuran  karena enzim bersifat spesifik Misal: penentuan glukosa dan fruktosa Dasar : glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi glu–6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin–5-trifosfat (ATP)

G-6-P + NADP  glukonat 6P + NADPH + H+ Glu + ATP  G-6-P + ADP Fruk + ATP  F-6-P + ADP G-6-P-DH G-6-P + NADP  glukonat 6P + NADPH + H+ NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi  diukur dengan spektrofotometer ( = 334, 340, 365 nm) PGI F-6-P  G-6-P G-6P-DH G-6-P + NADP  glukonat-6-P + NADPH + H+  Ditera

Penentuan Laktosa dan Galaktosa Dasar :  galaktosidase Laktosa + H2O Glukosa +  galaktosa Gal DH  galaktosa + NAD  asam galatonat + NADH + H+  ditera (I) pada = 334, 340, 365 nm

C. Cara Khromatografi Khromatografi kertas/TLC : diukur besarnya Rf tiap komponoen karbohidrat Jarak perpindahan molekul zat Rf =  Jarak perpindahan pelarut Harga Rf tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama dipengaruhi : - Macam zat pelarut - Ukuran bejana - Suhu - Macam fase tetap/stasioner - Sifat zat yang dianalisa

Kromatografi kertas untuk karbohidrat Zat penyangga : kertas yang tersusun oleh selulosa murni (misal: kertas whatman no.1 kecepatan merambat zat sedang), dipotong sesuai kebutuhan. Teteskan sampel (sekecil mungkin), penetesan 3-4 x (tetesan besar  terjadi tailing/pemisah tidak sempurna) Masukkan kertas ke dalam wadah berisi pelarut  pelarut merambat pada kertas sampai tanda (Solvent front)

Identifikasi : Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV pada : 254 – 370 nm Kimiawi : semprot dengan larutan kimia misal: gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3 gula non reduksi: naphtoresorcinol dlm asam fosfat. - Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan untuk: Aldosa pentosa (violet) Ketosa pentosa (hijau tua) Ketoheksosa (kuning coklat) Metil pentosa (hijau )

Uap Iodin Semprotkan pada kertas diruang asam Setelah kering akan timbul noda berwarna Hitung Rf, bandingkan dengan standar Zat pelarut: zat murni atau campuran Untuk penentuan gula sederhana: Campuran butanol : asetat : air atau asam asetat : pyridin : air (4:1:5)

Cara fisis (Cara optic) Penentuan index bias dengan refraktometer  tiap jenis gula punya index bias tertentu. Keuntungan: interval skala index bias cukup besar 1,30 – 1,75 sampel sangat sedikit (beberapa tetes) ketelitian :  0,0002 dinyatakan dengan = pengukuran pada t = 20oC dengan sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis.

Pengaruh konsentrasi terhadap () sangat kecil  diabaikan Suhu berpengaruh  perlu koreksi :

Penentuan karbohidrat dengan polarimeter Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri Keuntungan Sampel tidak mengalami kerusakan Dapat dilakukan cepat Agar hasil teliti, maka: Larutan harus jernih dan tidak berwarna Larutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif Konsentrasi sampel yang optimum: tidak terlalu pekat amupun encer

Penentuan dengan polarimeter Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang cairan dalam tabung [] : putaran/ritasi spesifik t : suhu pengukuran (oC) D : sinar Na (589 nm)  : sdf putar yang diamati C : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut) I : panjang tabung (dm)

Penentuan Serat Kasar Serat kasar : Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam organ pencernaan manusia maupun binatang. Dalam analisa : diperhitungkan banyaknya zat yang tidak larut dalam asam/basa encer pada kondisi tertentu.

Langkah penentuan serat kasar 1. Defatting : menghilangkan lemak dalam sampel dengan pelarut lemak 2. Digestion : - pelarutan dengan asam - pelarutan dengan basa  dalam keadaan tertutup pada temperatur terkontrol (mendidih)  segera dilakukan penyaringan untuk mencegah kerusakan lebih lanjut Protein menyulitkan penyaringan  perlu digesti pendahuluan dengan enzim proteolitik Residu = serat kasar yang mengandung 97% selulosa dan lignin  sisanya adalah senyawa yang belum dapat diidentifikasi