Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Kusniar Deny Permana 10505028.  Acetyl-CoA carboxylase merupakan enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi pembentukan malonyl-CoA.

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "Kusniar Deny Permana 10505028.  Acetyl-CoA carboxylase merupakan enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi pembentukan malonyl-CoA."— Transcript presentasi:

1 Kusniar Deny Permana

2  Acetyl-CoA carboxylase merupakan enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi pembentukan malonyl-CoA.

3

4  Enzim ini dapat diisolasi dari berbagai tumbuhan  Jurnal : ◦ Enzim diisolasi dari Cyclotella cryptica

5 Ѫ Kondisi Pertumbuhan Ѫ Bahan Ѫ Metode Analitis Ѫ Elektroforesis Ѫ Penentuan Aktivitas Acetyl-CoA carboxylase Ѫ Perparation of Cell-Free Extract Ѫ Pemurnian ◦ Fraksinasi ◦ Kromatografi Gel Filtrasi ◦ Kromatografi Afinitas

6  Cyclotella cryptica strain T13L diperoleh dari Culture Collection of Marine Phytoplank-ton di Bigelow Laboratory for Ocean Science  Sell dikultur dalam botol berisi 2L polikarbonat  Kultur diberi gelembung 0,5% CO 2 di udara (500 mL/menit) dan dijaga pada suhu 25 o C dibawah iluminasi konstan dari lampu fluorescence

7  Haloxyfop dan clethodim analytical grade

8  Protein diukur secara kuantitatif dengan metode Coomasie blue dye-binding (Bio-Rad) menggunakan y-globulin sapi sebagai standar  Radioaktivitas ditentukan dengan liquid scintillation counting dengan Beckman model LS9000 scintillation counter, menggunakan H#routine untuk quench correction  Biofluor dan Optifluor digunakan sebagai scintillation cocktail

9  SDS-PAGE 7,5% digunakan sebagai gel pemisah  Protein dipindahkan ke membran nitroselulosa dengan perangkat semidry electroblotting menggunakan sistem buffer dari Shafer-Nielsen et al  Protein dideteksi dengan prosedur Bio-Rad Biotin-Plot  Protein yang mengandung biotin dideteksi dengan prosedur yang sama

10  Aktivitas asetil-CoA diukur dengan penggabungan [ 14 C] bikarbonat dengan asam dan malonil-CoA yang stabil panas  Campuran hasil reaksi (0,3 mL) mengandung 100 mm buffer Tricine (pH 8,2), 0,5 mL asetil-CoA, 1 mm ATP, 2mM MgCl2, 10 mmKCl dan 10 mM [ 14 C] NaHCO3 (aktivitas spesifik 11,1 MBq/ mmol)  Reaksi diinisiasi oleh penambahan enzim dan diterminasi setelas 10 menit pada suhu 30 o C dengan penambahan 0,3 mL HCl 2N.

11  Sel disentrifuga pada 5000 g selama 5 menit dan dicuci dengan buffer MCD  Sel disimpan dalam mL buffer MCD  Sel dilewatkan pada French pressure cell pada psi  Pressate disentrifuga g selama 20 menit  Supernatan dilarutkan dalam MCD hingga konsentrasi proteinnya 5 mg/mL  Semua langkah di atas dilakukan pada suhu 4 o C

12 Fraksinasi Kromatografi gel filtrasi Kromatografi afinitas

13  (NH 4 ) 2 SO 4 jenuh ditambahkan pada crude extract dengan pengadukan untuk menghasilkan larutan dengan kejenuhan 30%  Larutan disentrifuga pada 8000 g selama 5 menit  Pellet dibuang, supernatan secara bertahap ditambahkan (NH 4 ) 2 SO 4 sampai kejenuhan 43, 50 dan 60%  Semua endapan dibuang kecuali yang terakhir.  Endapan dilarutkan dalam 5-10 mL buffer MCD dan akan digunakan pada tahap berikutnya

14  Larutan hasil fraksinasi dimasukkan ke dalam kolom 90x2,2 cm Biogel A-1,5 m (Bio-Rad)  Kolom dielusi dengan buffer MCD dengan laju alir 20 mL/jam.

15  Asetill-CoA karboksilase dielusi dalam kolom dengan menggunakan buffer MKD yang mengandung 0,5 g biotin/mL

16 HASIL

17  Setelah dilakukan tahap pemurnian, didapatkan enzim dengan aktivitas 14,6 μmol malonil-CoA/mg protein/menit  Terjadi peningkatan aktivitas spesifik sekitar 600 kali lipat.

18  Berat molekulnya 740 kD  Berat molekulnya 185 kD

19  Enzim ini memiliki pH basa optimum pada pH 8,2 tetapi stabilitas maksimum pada pH 6,5  Pada tahap fraksinasi pada pH 6,5 setelah 48 jam, enzim menunjukkan 97% aktivitas  Sedangkan pada pH 7,5 dan 5,5 hanya tersisa 15% dan 4%.

20  Enzim mengalami penurunan aktivitas tanpa adanya sulfuhydryl reductant  Adanya sitrat menstabilkan enzim ini  Enzim membutuhkan NaCl atau KCL untuk stabilitasnya.  Aktivitas enzim bergantung pada kation logam divalen, misalnya Mg 2+ maksimum pada konsentrasi 2 mM. 


Download ppt "Kusniar Deny Permana 10505028.  Acetyl-CoA carboxylase merupakan enzim yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi pembentukan malonyl-CoA."

Presentasi serupa


Iklan oleh Google